6. 体内实验验证hsa_circ_0004872抑制肿瘤发生和转移
通过皮下注射过表达hsa_circ_0004872的BGC-823细胞和对照组BGC-823细胞发现，过表达hsa_circ_0004872组生成的肿瘤明显小于对照组，并且肿瘤中Smad4和p21表达升高。尾静脉注射实验也发现过表达hsa_circ_0004872组肺表面形成的转移性结节明显要小于对照组。这些结果表明，hsa_circ_0004872能够抑制肿瘤的发生和转移。

 
7. hsa_circ_0004872受RNA编辑蛋白ADAR1调控
为了寻找调控hsa_circ_0004872的因素，作者通过对数据库中GC样品中基因表达情况进行分析发现RNA结合蛋白ADAR1在GC组中经常显著上升，并通过qPCR进行了验证。同时数据分析也显示GC 组织中ADAR1蛋白的高表达与短生存周期相关。于是，作者在GC细胞中敲降和过表达ADAR1，发现敲降ADAR1后hsa_circ_0004872表达上升，miR-224表达水平降低；而过表达ADAR1，hsa_circ_0004872表达降低并且miR-224水平上升。这些结果表明ADAR1可以通过hsa_circ_0004872调控miR-224。

8. Smad4通过ADAR1调控hsa_circ_0004872
最后，有趣的是，hsa_circ_0004872通过miR-224调控的靶基因Smad4是一个转录因子，作者通过ChIP-PCR实验和双荧光素酶实验验证到了Smad4可以结合ADAR1的启动子区，并且在GC细胞过表达Smad4会降低ADAR1的mRNA和蛋白水平。对数据库中GC组织样品的生信分析显示ADAR1的表达与Smad4的表达负相关，并且Smad4的低表达与短生存周期相关。

总结
本研究通过全转录组测序筛选出在GC组织中下调的hsa_circ_0004872，通过RIP-qPCR、pull down、和双荧光素酶实验验证了其通过海绵机制吸附miR-224从而调控下游靶基因p21 和Smad4，产生抑癌作用。并且通过ChIP实验和双荧光素酶实验验证了转录因子Smad4又通过调控RNA结合蛋白ADAR1调控hsa_circ_0004872形成一个反馈回路。

云序生物环状RNA研究优势
云序生物作为国内早期提供环状RNA测序的测序公司，自行建立的环状RNA数据库circDB，凭借物种覆盖广、数据量大、疾病背景多的特点为客户提供优质的服务。云序积累了超过10000例环状RNA测序的经验，样本覆盖20多个物种以及50多种疾病。云序生物提供系统性环状RNA服务，从筛选（circRNA测序）到验证（qPCR）再到机制研究（RIP、RNA pull-down、ChIP）以及上游表观调控（m6A甲基化等各类RNA修饰研究），全方位的覆盖环状RNA上下游分子机制验证的重要研究环节。除了提供组织和细胞的样本类型测序之外，我们还提供体液、血清血浆、外泌体石蜡样本等特殊样本的测序服务。