凝胶柱层析——考马斯亮蓝染色法测定真蛋白的方法介绍
考马斯亮蓝染色测定蛋白质是一种经典的方法,但按传统方法配成的显色剂却存在着溶解不完全、比色池上极易沉积等问题,实际操作时对测定的准确性干扰较大。为此2010年张弘等人对考马斯亮蓝显色剂中进行了改良,加入了大分子的醇类和酚类物质,新研制的显色剂溶液溶解度好,比色池上沉积很少,且稳定,存放一年不影响测定。
此外还研发出了牛奶蛋白质快速检测仪,该仪器体积小、操作简便、检测速度快、灵敏度高,且能有效消除添加的三聚氰胺、尿素、硫酸铵等无机氮,及水解植物和动物蛋白等小分子多肽氮对牛奶中蛋白质检测的干扰,从而能从根本上杜绝牛奶中掺假蛋白检测题,可用于现场牛奶真蛋白质快速检测。结果表明,牛奶中蛋白质分子量绝大部分集中分布在1×104～7×104u以上和1×104u以下分子量的蛋白质所占的比例很小。综合应用牛奶中蛋白质的分子量分布特征和考马斯亮蓝染色法的特性研发出。
该法通过对考马斯亮蓝进行改良,基于马斯亮蓝染色法的特性和牛奶中蛋白质分子量的分布特征研制出牛奶蛋白质快速检测仪。分子量约1 ku以上含氮物中的肽链和考马斯亮蓝结合,在波长595nm处达到最大吸收值。牛奶中的蛋白质主要是酪蛋白和清蛋白两大类,它们的分子量大多在1×104～3×104u;
蛋白质分离检测仪检测的结果表明:牛奶中的蛋白质分子量集中分布在1×104～7×104u,和考马斯亮蓝的显色作用非常明显,因此灵敏度很高。牛奶中的其他物质,如脂肪、多糖、维生素等均不与考马斯亮蓝作用,掺假物质,如三聚氰胺、尿素和硫酸铵等基本也不显色,因此能有效识别;
而水解植物和动物蛋白中,大部分是小分子肽,只有很少一部分的大分子蛋白质才能显色,但如果要达到和牛奶相同的显色值,含氮量要达到牛奶的20倍左右才能做到,因此,用牛奶蛋白质快速检测仪测定蛋白质,可有效地防止牛奶中掺假蛋白质的干扰,从而能从根本上杜绝牛奶中掺假蛋白的检测问题,可用于现场牛奶真蛋白质的快速检测。
