荧光分析法测定维生素 B2
一、实验目的
1．学习和掌握荧光光度分析法测定维生素B2的基本原理和方法； 2．熟悉荧光分光光度计的结构及使用方法； 3. 学习掌握固体及液体试样的荧光测试方法。
二、实验原理
当用一种波长的光照射某种物质时，这种物质会在极短的时间内，发射出一种比照射光波长较长的光，这种发射出来的光就叫做荧光。当照射光停止照射时，荧光也随之很快地消失。利用某些物质被紫外光照射后所产生的、能够反映出该物质特性的荧光，以进行该物质的定性分析和定量分析，称为荧光分析。
实验证明，荧光通常发生于具有刚性平面的л-电子共轭体系分子中。随着л-电子共轭度和分子平面度的增大，荧光也就越容易产生。因此几乎所有对分析化学有用的荧光体系都含有一个以上的芳香基团，芳环数越多，荧光愈强。能发荧光的纯无机物很少，通常是利用有机配位体与金属离子形成荧光络合物进行无机离子的分析。
图1．荧光分光光度计的结构原理图
荧光分光光度计工作原理（图 1）可简述为：光源发出的光束经激发单色器色散，提取所需波长单色光照射于样品上，由样品发出的荧光经发射单色器色散后照射于检测器上，检测器把荧光强度信号转变为电信号并经放大器放大后，由信号显示系统显示或者记录。
荧光光谱包括激发光谱和发射光谱两种。激发光谱是是指发射单色器波长固定，而激发单色器进行波长扫描所得到的荧光强度随激发光波长变化的曲线。荧光发射光谱是指激发单色器波长固定，发射单色器进行波长扫描所得到的荧光强度随发射光波长变化的曲线。一般所说的荧光光谱实际上仅指荧光发射光谱。这一光谱为分析指出了最佳的发射波长。
荧光定性定量分析与紫外可见吸收光谱法相似。定性时，是将实验测得样品的荧光激发光谱和荧光发射光谱与标准荧光光谱图进行比较来鉴定样品成分，一般荧光定性的依据是荧光光谱峰的个数、位置、相对强度及轮廓。
定量分析时，一般以激发光谱最大峰值波长为激发光波长，以荧光发射光谱最大峰值波长为发射波长，测量样品的荧光强度。对同一物质而言，荧光强度F与该物质的浓度c有以下的关系：
F=2.303ФfI0abc ⑴
Фf－荧光过程的量子效率； a－荧光分子的吸收系数；
I0－入射光强度； b－试液的吸收光程。
在I0和b 不变时，2.303ФfI0ab为常数，则⑴式可以表示为
F＝Kc ⑵
⑵ 即可作为荧光定量检测的依据。
图2 VB2的结构式
如图2 所示，VB2具有一个芳香环结构及л-电子共轭体系，在430 nm～460 nm 蓝光的照射下，发出绿色荧光，其峰值波长为527 nm。VB2的荧光在pH=6～7 时最强，在pH=11 时消失。
三、仪器与试剂
1．仪器：Cary Eclipse 荧光分光光度计(原美国瓦里安公司,现美国安捷伦公司)。 2．试剂：
（1）VB2 标准溶液（10.0 mg/L：准确称取10.0 mg VB2，将其溶解于少量的1% HAc中，转移至1 L 容量瓶中，用1% HAc 稀释至刻度，摇匀。转移至棕色试剂瓶中，置阴凉处保存。
（2）待测液：取市售VB2一片，用1% HAc 溶液溶解，定容到1000mL，贮于棕色试剂瓶中，置阴凉处保存。
四、实验步骤 1. 液体样品测试
1.1. 标准系列溶液的配制
取五个干净的25 mL 容量瓶，分别加入1.00、2.00、3.00、4.00 和5.00 mL VB2 标准溶液，再分别加入 4.00、3.00、2.00、1.00及0.00 mL 1%的醋酸，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀。 1.2．VB2发射光谱的制作
将激发单色器固定为449 nm，发射单色器在470-800 nm范围内进行波长扫描，分别制作五个标准样品的荧光发射光谱。 1.3．标准曲线的制作
以VB2标准溶液的浓度为横坐标，相应发射光谱的峰值荧光强度为纵坐标，绘制用于VB2定量检测的标准曲线并得出相应的标准线方程。 1.4．未知试样的测定
取待测液2.50 mL 置于25 mL 容量瓶中，加入2.50mL 1%的醋酸，用H2O 稀释至刻度，摇匀。用测定标准系列时相同的条件，测量其荧光强度。将测定的荧光强度代入标准曲线方程，计算出未知试样中VB2的浓度。
2. 固体样品测试
2.1. 制样
取适量VB2样品，置于样品池石英片上，旋紧样品池的螺丝，使VB2粉末在
石英片上平铺一层，再将样品池置于固体样品架上。 2.2. 固体VB2荧光发射光谱的制作
用与液体样品测试相同的参数设置，进行VB2固体荧光发射光谱的测试。
五、思考题
1．荧光测定时，为什么激发光的入射与荧光的接收不在同一直线上，而成一定角度？
2．改变激发波长，荧光发射光谱会有何变化？为什么？
