冷冻电镜三维重构
摘要：冷冻电子显微学从创立到现在已发展成为确定蛋白质分子，蛋白质复合物和细胞器结构的一种有效、的方法这表现在三位冷冻电镜技术的不同方面。这主要包括适合于显微镜真空环境的样品制备条件，减少辐射损伤的策略，提高未经染色的电子显微像的信躁比的方法和二位投影三位重构的不同方法。冷冻电镜通过高压快速液氮冷冻的制样方法能够使样品处在接近于生理环境的玻璃态冰中从而保持其天然构像，并且由于快速冷冻可以捕捉到某个反应过程的中间状态从而可以对大分子复合物进行生物学功能的动态研究。确定三维结构的方法主要有电子晶体学方法、单粒子重构法和电子断层成像技术。在主要的测定结构的方法种，冷冻电镜是唯一的能研究小到小的蛋白质，蛋白质复合物大到细胞器甚至整个细胞的方法。
关键词：冷冻电镜；三维重构；单粒子法；断层成像；电子晶体学
引言
在大量的基因序列被阐明后人们发现这还远远不能解释复杂的生命活动，必须对功能活动的执行者基因的表达产物蛋白质进行结构和功能上的研究才能更好的理解生命过程。而以蛋白质为主体的生物大分子的功能主要决定于它们的三维结构。因此以Ｘ射线晶体学、核磁共振技术(ＮＭＲ)、电子显微学和计算生物学为基本研究手段的结构生物学将在其中扮演越来越重要的角色。Ｘ射线晶体学是目前分辨率最高的结构测定方法，已经非常成功地解析了大量单个分子的三维结构。但是这种方法有一定的局限性：由于大分子复合物不易于形成三维晶体，很多疏水性蛋白也不易于形成晶体，或者只有在去除一些柔性区域后才能形成好的三维晶体，这限制了Ｘ射线晶体学的应用范围，另外由于晶格的约束干扰了对分子间相互作用，这并不利于对于蛋白质的功能进行研究。NMR非常适合对水溶性的蛋白质进行三维结构测定，虽然也发展了一些新的技术如固相核磁共振（solid-NMR）等可用于对小的膜蛋白的结构测定，但需获得在脂双层上高度有序排列的样品，而且分子量仍然是NMR的一个限制因素。
二十世纪七十年代Taylor K和Glaeser RM开创了冷冻电子显微术（cryo-electron microscopy,Cryo-ME），经过近三十年的发展，冷冻电镜技术已经成为研究生物大分子结构与功能的强有力的手段。最近几年冷冻电镜的发展在研究大分子结构上的分辨率已达到10-15 。虽然不及Ｘ射线晶体学,但它具有许多独特的优势：可以对均一的（如膜蛋白的二维晶体，二十面体对称的病毒等对称结构）不均一的（如核糖体等）样品用不同的方法进行三维结构重构，可以对生物大分子及其复合物或亚细胞结构进行测定，使小到蛋白质大到真核细胞的三维结构得以确定，分子量大小跨越了12个数量级。通过快速冷冻可以将样品保存在生活状态，其结构更接近功能活性状态；由于快速冷冻可以捕捉到反应过程的瞬时状态从而易于进行时间分辨层面上的研究，从而对一些反应瞬时过程，和反应中间体进行研究，有助于对蛋白质的动力学特性和功能的研究。
三维冷冻电镜技术将更完善的样品制备方法，先进的仪器设备，更好的成像方法和强有力的数据处理和运算方法结合起来，使结构测定的分辨率不断得到提高。样品制备主要采用快速冷冻的方法，以保持其天然活性；仪器设备则可采用场发射电镜和CCD（charge-coupled detector,电耦合探测器）摄像系统；确定结构的方法主要有电子晶体学、单粒子法和电子断层成像技术，对于数据处理则主要借助各种软件和傅立叶变换的算法进行二位图像的三维重构以获得实物空间的三维结构。本文将在这几个方面介绍冷冻电镜三维重构技术及进展。
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