荧光法测定果蔬及饮料中的抗坏血酸
新编实验
荧光法测定果蔬及饮料中的抗坏血酸
实验目的
掌握分子荧光分析法的基本原理；了解Rf530荧光仪的使用方法；熟悉荧光法测定果蔬及饮料中的抗坏血酸含量的方法。
实验原理
维生素C 又名抗坏血酸，自然界存在的有L型、D型两种，D型的生物活性仅为L型的1/10。维生素C 广泛存在于植物组织中，新鲜的水果、蔬菜中含量都很丰富。维生素C 具有较强的还原性，对光敏感，氧化后的产物称为脱氢抗坏血酸，仍然具有生理活性，进一步水解则生成2,3-二酮古乐糖酸，失去生理作用。食品分析中的所谓总抗坏血酸是指抗坏血酸和脱氢抗坏血酸二者的总量，不包括二酮古乐糖酸和进一步的氧化产物。
测定维生素C 的常用方法有靛酚滴定法、苯肼比色法、荧光法和高效液相色谱法等。靛酚滴定法测定的是还原型抗坏血酸，该法简便，也较灵敏，但特异性差，样品中的其它还原性物质（如Fe2+、Sn2+、Cu+等）会干扰测定，测定结果往往偏高。苯肼比色法和荧光比色法测得的都是抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的总量，其中以荧光法受干扰的影响较小，准确度较高。高效液相色谱法可以同时测得抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的含量，选择性好、准确度高、重现性好，但对样品前处理要求高。
本实验采用的是荧光分析法，其原理是通过将样品中还原型抗坏血酸经铜离子催化被氧化生成脱氢型抗坏血酸后，与邻苯二胺（OPDA）反应生成具有荧光的喹唔啉，依据荧光强度与脱氢抗坏血酸的浓度在一定条件下成正比，测定食物中抗坏血酸的总量。
试剂及仪器
Rf530荧光分光光度计，硫酸铜溶液（2.0 mg/ml），邻苯二胺（0.3 mg/ml），抗坏血酸标准溶液（25.0 mg/L），乙酸-乙酸钠-硫酸缓冲液（pH 5.6）。
实验内容
（1）样品处理
称取一定质量的果蔬（25g左右），加入一定质量的蒸馏水（25g左右），打成匀浆后过滤，取5.0 ml滤液至50 ml容量瓶中，定容，放入冰箱内保存备用。
液体样品不需要处理，或稀释一定倍数后备用。
（2）标准溶液及样品溶液的配制
标准溶液的配制：取6个10 ml 比色管（编号1-6），分别加入0.0、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 ml 抗坏血酸标准溶液，再依次分别加入2.0 ml 缓冲液，0.40 ml 硫酸铜溶液和2.0 ml OPDA溶液，定容至10 ml。20 min后可进行荧光测定。
样品溶液的配制：取1个10 ml 比色管（编号71），加入1.0 ml待测样品溶液，再依次加入2.0 ml 缓冲液，0.40 ml 硫酸铜溶液和2.0 ml OPDA溶液，定容至10 ml。20 min后可进行荧光测定。
（3）荧光激发和发射光谱测定
取6号溶液于荧光比色皿中，在荧光仪上分别扫描其荧光激发光谱及发射光谱：首先以351 nm为激发波长，扫描发射光谱，确定最大发射波长；然后以选定的最大发射波长扫描激发光谱，确定最大激发光波长；最后再以选定的激发波长扫描发射光谱。记录最大激发和发射波长。
（4）标样及样品检测
以选定的最大激发和发射波长，依次测定1-6号标样的荧光强度；在相同条件下，测定的7号样品的荧光强度。
结果处理
标准曲线的绘制：根据1-6号标样的荧光强度，以荧光强度对浓度作图，得到标准曲线。
根据7号样品的荧光强度，在标准曲线上读出样品溶液中抗坏血酸的含量；再根据样品处理及溶液配制过程中的稀释关系计算原始样品中抗坏血酸的含量。
注意事项
（1）本实验全部过程应尽量避光。
（2）邻苯二胺溶液在空气中颜色会逐渐变深，影响荧光衍生反应，故应用棕色瓶配制，在冰箱中保存不超过3天。
（3）不同的样品中抗坏血酸的含量不相同，称取的样品量可酌量增减。
