从鼠弓形虫抗原致敏诱导抗弓形虫感染的保护免疫应答
实验概要
通过注射在体外用TAg致敏过的来自于DC细胞的外质体，在体内诱导了弓形虫属特异性Th1分子免疫应答并获得了抗弓形虫感染的保护效应。研究证实致敏的DC衍生外质体能够对鼠弓形虫感染和其它某些病原感染产生免疫保护。这种无细胞疫苗对于人类疫苗策略是一种很有吸引力的保护工具。
实验材料
动物：8-10周龄雌性小鼠C57BL/6(H-2b)
寄生虫：鼠弓形虫RH株
实验步骤
1. 弓形虫抗原（TAgs）的准备
鼠弓形虫速殖子洗涤，超声处理后离心；用蛋白含量试剂盒测定离心产物，以牛血清白蛋白作为标准；等份相同超声处理，做弓形虫抗原，存于-20度。
2. TAg致敏或不致敏的DC2.4细胞的细胞表面标志
为了分析TAg的效力，200万的DC2.4细胞悬浮于15ml介质中，加有L-谷氨酰胺、青霉素-链霉素、5%热灭火胎牛血清，过滤。培养于细颈瓶。这些DC细胞用50μg/ml TAg致敏18h.流式细胞计数法定量表面分子的表达；
在进行特殊染色之前，先用2.4G2抗体孵育10min来阻止在细胞计数时抗体结合FC受体。细胞用PBS洗两次，然后与MAb在4度下孵育30min。在进行细胞计数分析前将细胞再用PBS洗两次，然后悬浮于500μL的PBS。标记的细胞用流式细胞仪器分析。
3. DC2.4外质体的准备
差别超离心法分离DC2.4细胞系上清液中的外质体。
DC2.4细胞被洗后，分别重新培养于有或无TAg的新鲜介质中18h。上清液收集并离心300×g 10min除去细胞。上清液连续离心，4000 30min；10000 30min；100000 60min。产物在1ml PBS悬浮，然后离心 100000 60min。
产物悬浮于200μl PBS,然后用Micro-BCA kit测定蛋白含量。从上清液中大约获得5μg的外质体。外质体制备的纯化可用电镜确认。
4. 外质体的电镜检查
外质体制剂用蒸馏水洗之前先存放于涂抹了碳的铜载网1min。格网用乙酸双氧铀溶液负染1min，充分干燥后电镜观察。
5. 外质体的寻靶
用50μg的DC2.4细胞衍生的外质体或500万DC细胞与Cr51在37度下标记1h，然后洗去未参与标记的Cr51。50μg的DC2.4细胞衍生的外质体或500万DC细胞被注射入受体小鼠的尾静脉。小鼠在第2、6、24后死亡。收集血液和尿液，肠、肺、肾、肝、脾、脑、腘淋巴结被分离出并用3ml 1%的聚乙二醇辛基苯基醚相同处理。所有器官的放射现象用γ计数器计数。表达值以放射性与其他身体部位相比时的百分比。每组试验用2只小鼠。
6. 外质体免疫和弓形虫入侵
在所有试验中，每间隔15天增加一批小鼠。静脉注射相同剂量的10μg的经TAg致敏的和未致敏的DC2.4细胞衍生物外质体，25万经TAg致敏的和未致敏的DC细胞，或10μg的TAg。对照组未经过处理。第二次免疫后10天口腔灌服30个或10个鼠弓形虫76K株囊肿。
为了研究细胞免疫应答，在第二次免疫后第十天，在未感染鼠弓形虫前收获脾细胞。
为了研究体液免疫应答，在第二次免疫后第21天收集血清。
每天观察攻击30个囊肿的小鼠的死亡率。攻击10个囊肿的小鼠，一个月后杀死取脑。每个脑分别加入5ml的PBS并研碎。在显微镜下计数每个脑匀浆的囊肿。结果不同的用标准差表达。
7. 免疫血清蛋白印迹
二次免疫后第21天从鼠眼球收集血清样品，用于做免疫印迹。电泳和免疫印迹法纯化鼠弓形虫速殖子，作为抗原的来源。
8. 特异性抗原增殖反应的测量
二次免疫后第10天收获的脾细胞用不锈钢压滤，然后再用血液尼龙过滤网过滤除去组织碎片，获得单个细胞悬浮。用低渗休克法除去脾红细胞。脾细胞悬浮于RPMI-1640，含有5%的FCS，25mM的HEPES,2mM的L-谷氨酰胺，1mM丙酮酸钠，5×10（-5）M的β-巯基乙醇，青霉素-链霉素，一式三份添加到平地的96孔微量滴定板中，每孔加200μl培养基或含有TAg的培养基，50万脾细胞。10μg/ml的刀豆素A用于确定增生。平板在5%二氧化碳、37度条件下孵育3天，加入胸苷。再孵育18h后，用纤维玻璃过滤收集细胞，用液体闪烁计数检测放射性。增生的表达作为刺激指数。
9. 细胞因子浓度的测定
脾细胞培养在24孔平板中，每孔加500万细胞和1ml培养基或含有TAg的培养基。收获无细胞的培养基上清液并分析IL-2 (at 24 h)，IL-4 (at 24 h)，IL-5 (at 48 h)，IL-10 (at 96 h)，and IFN-γ(at72 h) 活性。细胞因子浓聚物的测定用商品化的酶联免疫吸附测定试剂盒，根据商家的说明，参照相应的已知的小鼠重组体IL-2，IL-4，IL-5，IL-10，和IFN-γ标准曲线。分析的检测极限是50 pg/ml for IL-10，20 pg/ml for IFN-γand IL-5，10 pg/ml for IL-4和IL-2。
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toxoplasma gon
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