实验步骤 |
一 材料与设备
1 ) 5 mol/L NaOH
2 ) 寡聚脱氧胸苷 (oligo(dT) ] 纤维素
3) DEPC 处理的水
4) 1X 加样缓冲液:20 mmol/L Tris-CL PH (6.7). 0.5 mol/L NaCl, l mmol/L EDTA( pH 8. 0 ). 0.1% 十二烷基肌氨酸钠
5 ) 洗脱缓冲液 : 10 mmol/L Tris-Cl ( PH7. 6 ) , 1 mmol/L EDTA( PH 8.0) , 0.05% SDS
6) 3 mol/ L NaAc (pH5.2)
7 ) 乙醇
8) TE 缓冲液
二 操作方法
1)
先用 10 ml5mol/LNaOH 清洗硅化的层析柱,然后用水冲洗。取 0.5 g oligo(df) 纤维素干粉加于
1m]0.1mol/LNaOH 中,倒人柱内,以约 l0 ml 的水冲洗。(层析柱可用硅化的巴斯德吸管堵上已硅化的玻璃棉制成或用容量为 2 ml
的已硅化的一次性柱子
2) 用 10〜20℃ 加样缓冲液平衡柱子,至流出液 pH 约 7.5
3) 于 70℃ 加热含 2 mg 总 RNA 的水溶液 10min,迅速冷却至室温,加等体积的 2X 加样缓冲液,上样,立即用无菌试管收集流出液。并以一倍柱体积的加样缓冲液洗涤,将流出液于 70℃ 温育 5 min,重新上柱 2 次。
4) 用 5〜10 倍柱体积的加样缓冲液洗柱,分步收集洗出液,每份 1 ml,测定每一收集管的 OD260。洗脱至 OD260 很小或为零。
5) 用 2〜3 倍柱体积的洗脱缓冲液洗脱 Poly(A)ˉRNA,以 1/3〜1/2 柱体积分步收集洗脱液。
6)调整所收集的 KNA 溶液的乙酸钠浓度至 0.3mol/L, 加 2.5 倍体积乙醇,一 20℃放置过夜或干冰/乙醇中 30 min
7)
于 4℃ 10000 g 离心 15mim 沉淀 RNA。弃去乙醇,再用 70% 乙醇洗沉淀. 弃去 70% 乙醇,晾干沉淀,重溶于少量无
RNA 酶的 TE 缓冲液。取在 70℃ 加热 5 min 后,在 1% 琼脂糖凝胶电泳中检査 RNA 的质量。
S)poly(A)+1RNA 溶液可直接于 70℃ 保存,或加 3 倍体积乙醇保存于-70℃
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