UHPLC和高分辨率台式质谱仪联用分析霉酚酸酯的降解产物1
前言
强制降解实验能揭示各种环境因素对原料药和制剂的影响。它能提供药品安全信息、确定推荐储存条件、保质期和分析方法的特异性。而降解产物的信息能帮助改进化合物或配方的发展。
霉酚酸酯（MMF）的商标名称为骁悉（CellCept），是一种免疫抑制剂和霉酚酸（MPA）的前体药物。 MMF 广
泛的应用在治疗器官移植排异反应和自体免疫疾病的移植药物中。本研究选择 MMF 作为模型化合物。
本文开发了一种快速可靠的分析霉酚酸酯降解产物的完整工作流程，使用的仪器是赛默飞世尔科技的 AccelaTM
UHPLC
系统和台式 Orbitrap Q Exactive FocusTM 质谱仪，数据处理采用 Mass FrontierTM
软件。霉酚酸酯在热和过氧化物催化下的降解研究的 pH 值设定为 2.0、 3.5、 6.0 和 8.2。采用 HRAM
全扫描和数据依赖MS/MS 在高分辨率和极性切换模式下实现降解产物的快速鉴定。 HRAM MS 和 MS/MS 谱图以及正 /
负离子模式切换，能可靠完成降解产物的定性和结构鉴定。
实验方法
材料与试剂
霉酚酸酯 API CAS# 128794-94-5 购自 2A PharmaChem（Lisle， IL），纯度 >98%。
霉酚酸酯降解产物标准品
霉酚酸， CAS# 24280-93-1 Sigma-Aldrich。
霉酚酸酯杂质 G， CAS# 224052-51-1， Molcan Corporation，加拿大多伦多
霉酚酸酯杂质 A， CAS# 1322681-36-6， Molcan Corporation，加拿大多伦多
盐酸、乙酸铵、氢氧化钠和过氧化氢购自 Sigma-Aldrich。
样品前处理
● 霉酚酸酯储备液，浓度为 2.5 mg/mL 的乙腈溶液，称取 25 mg 标准品配制在 10 mL 乙腈中。
● 盐酸（0.01 N， pH 2），乙酸铵（5 mM， pH 6），氢氧化钠（0.01 N， pH 8）和过氧化氢（3%， pH 8.2）。购买的 30% 过氧化氢用水稀释 10 倍后用于酸、碱和氧化研究。用氢氧化铵或乙酸调节强制降解溶液 pH 值。
●
用如上 pH 2、 pH 6、 pH 8 的溶液和过氧化氢（3%， pH 8.2）将浓度为 2.5 mg/mL 的霉酚酸酯储备液稀释
10倍配制浓度为 0.25 mg/mL 的强制降解溶液。强制降解溶液放置于 60℃烘箱中。在放置的第 1、 20、 48 和
72小时分别取样，直接进样到 LC/MS 中进行分析。
HPLC 方法
HPLC 系统： Thermo Scientific Accela 1250 pump, Open Accela Autosampler and Accela PDA
色谱柱： Thermo Scientific Dionex Acclaim 2.1×150 柱 , 2.2 μm
柱温箱温度： 35℃
流动相：A - 0.1% 甲酸水溶液
B – 含 0.1% 甲酸的乙腈
C - 100 mM 甲酸铵的水溶液（pH 5）
梯度洗脱： 0-0.5 min 保持 20% B，然后在 15 min 内线性增加到 40%B
流速： 500 μL/min
进样体积： 1 μL
质谱方法
质谱仪： Thermo Scientific Q Exactive Focus 台式高分辨质谱
仪，配备 HESI-II 离子源
离子化模式： ESI 正 / 负离子切换
全扫描采集： m/z 120-1000 amu，分辨率为 70,000（FMHW@m/z 200）
MS/MS 采集： 35,000 分辨率下响应强度数据依赖采集
HCD 碰撞能量： 35%， 25% 阶梯变化
结果与讨论
I. UHPLC- 高分辨率 MS 快速测定降解产物
采用 UHPLC- 高分辨率 MS 快速分析降解产物。高质量的 HRMS 全扫描图谱为测定降解产物的元素组成提
供了重要信息，并从随后的数据依赖 MS/MS 获得分子离子的裂解信息。
