重组G蛋白偶联受体的纯化实验（二）

3.受体-特异配体亲和层析

用一般的亲和标签富集受体之后，可能需要第二步纯化以分离到纯净、有功能的受体蛋白。这主要是因为：①第一步纯化得到的受体还不够纯, 仍有其他污染物。例如，用 XAaxanthineamineC0ngener，拮抗剂）层析柱纯化腺苷受体可去除其中的一个主要污染物 (WeiBandGriSshammer，2002)。类似的, 用 NT[神经降压肽 (neurotensin)，激动剂] 层析柱 (Whiteetal.，2004) 纯化神经降压肽受体 NTS1 可得到均一物质; 用阿普洛尔 (alprenolol，非选择性, 肾上腺素能受体抬抗剂) 琼脂糖层析柱纯化，肾上腺素能受体。从一般亲和树脂上洗脱的受体可能包含功能性的和非功能性、错误折叠的受体，而后续受体_特异配体亲和层析也能去除非功能性的受体部分。②一个 (或两个连续的) 一般亲和标签步骤能得到几乎纯净的受体，然而却是功能性和非功能性受体的混合物。一般亲和标签不能从错误折叠但仍是去污剂可溶的受体中分辨出正确折叠的受体。受体的错误折叠可能发生在表达宿主中，也会因在去污剂溶液中不稳定而发生。受体-特异配体亲和层析柱能够从错误折叠的受体中分辨出有功能的受体。例如，阿普洛尔层析柱可被用于分离有功能的体-肾上腺素能受体 (Kobilka，1995)。③在粗溶的受体中加入生物素化的肽配体 (PACAP38) 及亲和素树脂，一步纯化方案能够制备高度富集的垂体腺苷酸环化酶促多肤 (pituitaryadenylatecyclase-activatingpolypeptide，PACAP)。

4.去污剂增溶 GPCR的分析

去污剂增溶的、有功能的受体含量可以通过放射配体结合 (radioligand-binding) 实验确定。理想状态下，放射配体应以较高的亲和力结合受体，并表现缓慢的解离速率，从而在从游离配体分离出配体-受体-去污剂复合物的过程中，能够避免非平衡状态中导致的可能的假象 (artifact) 产生。HUlme(1990) 概述了受体结合研究。对于具有亲水性而不会掺人空的去污剂胶束的标记配体，放射配体结合分析的效果最好。相反, 疏水性的配体会插入空去污剂胶团而导致非特异的高背景信号。

推荐使用氨基黑分析法 (amidoblackassay)(SchaffnerandWeissmann,1973) 检测蛋白质的含量。在去污剂和配体存在的条件下, 许多检测蛋白质含量的方法不准确。氨基黑分析包含一个沉淀步骤用于去除去污剂、配体或其他缓冲成分。需要注意的是，不是所有的蛋白质与染料 (如氨基黑) 有相同的结合力，这意味着如果受体与染料的结合与参比蛋白质 (BSA) 不同，则蛋白质浓度测定也许会有偏差。

从配体结合数据和蛋白质含量分析，可以计算出 Bmax 的实验值 (nmol 功能性受体/mg 蛋白质) 并将其与纯的功能受体特异结合的理论值比较。需要注意的是, 因为不同的氨基酸组成理论值对每个 GPCR 都是特异的。如果实验值与理论 Bmax 值匹配, 则说明纯化到了活性受体。

四、增溶和纯化重组神经降压肽受体 NTS1

NTSl 增溶、纯化和分析的更详细的描述见 White 和 GriSShammer(2007) 的文献，这里主要讨论其要点。NTSl 融合蛋白纯品的获得可通过联合使用 IMAC 层析柱和 NTSl 特异配体层析柱实现。

将 NTSl 与麦芽糖结合蛋白 (mahose-bindingprotem,MBP) 融合可在大肠杆菌中实现具有功能的嵌膜 NTSl 表达（Grisshammeretal.,1993)。表达质粒编码含信号肽序列的 MBP 及其后的受体。在大肠杆菌中前导肽酶去除信号肽后，用于纯化的 NTSl 融合蛋白 MBP-T43NTR-TrxA-H10(NTSl-624) 的序列组成依次为: 成熟的大肠杆菌 MBP(Lys1 到 Thr366)、N 端截断的大鼠神经降压素 I 型受体NTS1(T43NTR，THr43 到 Tyr424)(Tanakaetal.,I”。）、大肠杆菌硫氧还蛋白（TrxA,Ser2 到 AlallM)[TrxA 会增加融合蛋白的表达量，见 Tucker和 Grisshammerd9%)] 和 10 个组氨酸标签（HlO)(GrisshammerandTucker，B97)。表达在低温 (22°C) 中进行，由一个低拷贝表达质粒的弱启动子驱动。

这避免了新生受体链导致的大肠杆菌转位和膜插入机制过载的可能性。在任何给定的时间点蛋白质产量都很少，但 2 天后就能观察到积累的正确折叠的受体。纯化 10 mg 的 NTSl 融合蛋白通常需要 250 g 湿重的大肠杆菌菌体，相当于 50L 的培养规模（Whiteetal.，2004), 这很容易通过发酵实现。

在大肠杆菌中 NTSl 融合蛋白的表达量处于中等水平（即污染物和目的受体的比值高）。因此，需要一个优化的能够有效富集受体融合蛋白的 IMAC 方案。为达到这一目的，在 Ni2-NTA 层析柱纯化中，采用了 10 个组氨酸残基的 C 端标签而不是 6f(GrisshammerandTucker,1997)。Ni2+-NTA 树脂和 10 组氨酸标签受体的紧密结合允许使用含 50 mmol/L 的咪唑的严格洗涤步骤。这个浓度的咪唑去除了结合于 Ni2-NTA 树脂的绝大部分大肠杆菌的污染物，但不会洗脱目的融合蛋白。这一策略不仅可以从粗制的膜中有效的纯化受体，而且也能很好应用于全细胞裂解产物 (GrisshammerandTuck-er，1997)0NiB 缓冲液中的高钠离子浓度和高咪唑浓度会减弱 NT 和 NTSl 的亲和力, 从而会阻碍从 Nia-NTA 层析柱上洗脱下的功能性受体与 NT 层析柱的直接结合。因此须用缓冲液将 NaCl 和咪唑的浓度从 200 mmol/L 稀释到 70 mmol/L，以使功能性的 NTSl 能够结合到 NT 层析柱上。NTSl 和 NT 的结合对 NaCl 敏感，可用高浓度的 NaCl 将受体从 NT 层析柱上有效的洗脱下来(图 36.1)。

1.NTSl 融合蛋白的增溶

(1) 除非另有说明，所有的步骤均在 4°C 或在冰上操作。

(2) 室温下用锤子压碎塑料薄板之间的 250 g 冷冻细胞。将细胞放入 Waring 搅拌器。

(3) 加人 500 mL 冷的 2X 增溶缓冲液 [100 mmol/LTris-HCKpH7.4)、60%(V/V) 甘油、4OOmmol/LNaCl]。运行搅拌器使细胞充分重悬。

(4) 将细胞悬液转人有磁棒的烧杯中。由于搅拌器会将空气引入悬浮液，这一步很难确定体积。因此最终的体积在第 (11) 步调节。

(5) 在搅拌的过程中，加入蛋白酶抑制剂储备液各 ImL(PMSF,70 mg/mL 溶于乙醇; 亮抑酶肽，Img/mL 溶于水; 抑肽素 A,l.4 mg/mL 溶于甲醇)、5 mLImol/LMgCl2(终浓度为 5 mmol/L)、0.6 mLDNaseI 溶液（10 mg/mL,SigmaD-4527)和 50 mL 冷 H20。

(6) 在搅拌的过程中，滴加 100 mLCHAPS,/CHS 储备液 [6%(w/V)(3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-l-propanesulfonate)/1.2%(m/V)cholesterylhemisuccinateTrissaltinH20]。CHS 自身不溶于水，需要在 CHAPS 中溶解。

(7) 在搅拌过程中，滴加 100 mLDDM 储备液 [10%(W/V) 水溶十二烷基-1-麦芽糖苷]。

(8) 继续搅拌 15 min。

(9) 超声 33 min(8s/g 细胞），1s 开，2s 关，第 4 级 (Misonix 公司超声波破碎仪，0.5 英寸，平底探头）。保持样品处于冰水浴以避免超声过程中局部加热。这一温和的超声步骤能加强受体的增溶效率。

(10) 每种蛋白酶抑制剂额外各加人 ImL。

(11) 边搅拌边滴加冷的 H2O 至终体积 IL。

(12) 再揽拌样品 30 min。

(13) 超速离心样品 1 h[Beckman45Ti 转子或同等转子，45000r/min(235000 g 于 Fmax)]。

(14) 回收增溶后受体 (上清液中）。

(15) 边搅拌边滴加咪唑储备液 (2moLL, 用 HCl 调节到 pH7.4, 终浓度 50 mmol/L)。0.22pm 滤器过滤样品。此时可用 IMAC 层析柱和神经降压素亲和层析柱从此上清液中纯化受体。

2.固定化金属亲和层析纯化 NTSl 融合蛋白

此纯化可用 AktaPurifier(GEHealthcare) 层析系统的两柱模式在冷室全自动完成，细节详见 White 和 Grisshammer(2007)及 White 等(2004)的文献。纯化仪装备有气体传感器、样品泵 P950、改良的进样阀、一根 100 mL 的 Ni2+-NTA 层析柱、一根 20 mL 的 NT 层析柱和分离组分收集器 Frac950。所有的纯化步骤也可用更简单的设置操作，即先用 IMAC 层析柱纯化，随后将 Ni2+-NTA 层析柱的洗脱液稀释后再上样加载到 NT 层析