GOLM1调控肝癌转移机制研究
癌症的转移机制一直是科学家们关注的热点。来自复旦大学钦伦秀课题组的研究人员发现一个和HCC转移密切相关的基因——GOLM1。深入的分子机制研究显示，GOLM1作为一个致癌基因促进了肝癌的生长和转移，而这个过程是通过选择性地与表皮生长因子受体EGFR结合，介导EGFR/RTK 锚定到trans-Gogi network上，促进其回收到质膜上而激活下游激酶。该研究为深入理解肿瘤的转移机制及为转移开发新的治疗方案提供了依据。
研究背景
转移是肿瘤的一大特征，也是其很难攻克的重要因素之一。已有的研究发现肿瘤的转移过程由复杂的信号转导调控网络控制。生长因子反馈受体激酶（RTKs）在肿瘤的转移过程中起着重要的调控作用。RTKs的内吞和回收机制，增强了生长因子对有丝分裂的控制，这也是癌细胞的一个显著性特点。而RTKs的回收和降解过程又是受到高尔基体（Golgi）的控制。Golgi相关的分子是如何具体调控这个过程，又是如何与肿瘤转移联系起来，本研究中这个角度出发，为我们详细解读了GOLM1在肝癌转移中的作用角色。
研究思路
研究结果
1． HCC转移特异性基因筛选
为了筛选和HCC转移相关的基因，研究人员利用高通量表达谱芯片，对肝外转移组织（EHMH），自由转移肝组织（MFH）和正常肝组织进行了全基因组表达模式差异分析。结果显示，一个编码高尔基体相关蛋白GOLPH2的基因——GOLM1，只在EHMH组中特异性显著上调。由于高尔基体在蛋白合成和转运中的重要作用，研究人员把GOLM1作为候选研究基因。
通过qRT-PCR和IHC分析，研究人员发现GOLM1的mRNA和蛋白水平在HCC中，特别是EHMHs中显著增高。早期复发HCCs病人组织中，GOLM1的蛋白水平也明显高于无复发（RF）病人。因此，GOLM1可能与HCC的转移密切相关。
2. GOLM1与HCC病理表征分析
为了进一步探究GOLM1与HCC转移的关系。研究人员运用组织芯片对375个病人进行了GOLM1表达分析，发现高表达组肿瘤微管侵袭增高，总生存率（OS）低，复发（TTR）时间早。Cox比例风险回归分析显示，高表达的GOLM1可作为OS和TTR的独立诊断指标。因此，GOLM1的过量表达与HCC的不良预后密切相关。
3.GOLM1调控功能分析
首先，对不同HCC细胞系的检测发现，MHCC-97H，HCC-LM3，Huh-7细胞中GOLM1都是高表达的。同时，这些细胞会伴随有高的侵袭和转移能力。在细胞中用shRNAs人为降低GOLM1表达（GOLM1-KD），发现对细胞的增殖能力有一定抑制作用，细胞的转移和侵袭能力也有所抑制。再将GOLM1 cDNA转移至GOLM1-KD细胞，可以补救下调抑制表型。在GOLM1低表达细胞系中转染上调GLOM1（GOLM1FLAG），也能限制增加细胞的增值，侵袭，转移能力。
裸鼠皮下移植模型分析显示，MHCC-97HshGOLM1组肿瘤大小显著变小，肺转移也明显降低。而在小鼠模型中上调GOLM1可显著增加肿瘤的生长和转移。因此，内体内外的gain-和loss-of-function实验表明GOLM1对促进HCC生长和转移非常重要。
4. GOLM1作用机制分析
通过免疫亲和纯化和高通量液质检测（LC-MS/MS），研究人员发现EGFR蛋白可以与GOLM1结合。在不同细胞中的co-IP实验也验证了他们的结合关系。通过对EGFR/RTK下游蛋白检测也发现，GOLM1-KD可显著降低MMP9的表达。因此，GLOM1可能通过结合和激活EGFR/RTK信号通路，调控了HCC的生长和转移。
那么，GOLM1和膜蛋白EGFR之间具体是怎么关联的呢？共聚焦显微观察显示，EGF刺激可影响GLOM1的分布，GLOM1从trans-Golgi network(TGN)转移到了胞质形成Rab5-positive 囊泡，而和内源EGFR共定位。在肝细胞中可以看到，内化的EGFR会多次和Rab5-positivede GOLM1发生交互作用。定量co-IP和半定量荧光检测显示在EGF刺激后，两者之间最多有15-30 min作用时间。进一步的温度阻遏和释放等实验也显示，GOLM1-KD会抑制EGFR从TGN到浆膜上。因此，GOLM1可招募EGFR/RTK，进而促进其胞内运输和下游信号调控而促进HCC生长和转移。
那么，GOLM1是否影响了EGFR/RTK的内吞和回收过程呢（这对于肿瘤转移非常重要）？结果显示，GLOM1-KD可在EGR刺激后增加EGFR的降解，减少EGFR到质膜的回收。那么，HCC转移是否以此相关？研究人员首先寻找了GOLM1和EGFR/RTK互作的区域，通过一系列的突变构建，发现除了△2–12, △5-12, 和 △13-35都可以和EGFR/RTK结合，点突变G7，R8，R9，M11，K12的GOLM1可以完全抵消掉两者之间的结合。进一步的GST pull-down实验也表明GOLM1的胞浆区域（3-12位氨基酸），可直接绑定到EGFR/RTK上去。
这么这种结合是否影响了EGFR/RTK的回收和细胞迁移呢？在HCC细胞中转染突变和删除片段的GOLM1，EGFR/RTK的回收和细胞迁移能力减弱。在PLC细胞中转染GOLM1，EGFR/RTK的回收和细胞迁移能力增强。因此，正反实验都显示，GOLM1影响EGFR/RTK的回收和细胞迁移能力。
这个过程是否和其他蛋白相关？通过进一步的分析和实验，研究人员发现GLOM1可招募Rab11和EGFR/RTK形成复合体，返回到细胞表面而驾驭下游信号，影响细胞的侵袭。
通过构建两个氨基酸突变株（GOLM1-RVAA和GOLM1TMD），研究人员发现GOLM1在PLC细胞中的分泌受到抑制，GOLM1TMD不能与EGFR共定位，EGFR的回收也受到影响。因此，干扰GOLM1的外分泌或高尔基锚定会减少EGFR的回收，进而影响了HCC细胞的迁移。
研究结论
该研究通过前期高通量筛选，找到了和HCC转移相关基因GOLM1，深入的功能和分子作用机制实验显示，GOLM1通过选择性地与表皮生长因子受体EGFR结合，介导EGFR/RTK 锚定到trans-Gogi network上，促进其回收到质膜上而激活下游激酶，而促进HCC的生长和转移。该研究为我们深入理解肿瘤的转移机制提供了新的证据。
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