试剂、试剂盒 叶片悬浮缓冲液EDTA 水溶液硫脲缓冲液硫酸铵溶液SDS 溶液

仪器、耗材 细胞等电聚焦电泳仪等电聚焦托盘及盖

实验步骤

3.1 叶和根组织的收集和沉淀蛋白

( 1 ) 从植物的中部切取绿色叶片，迅速放入塑料袋里冷却。如果没有冰箱，可先放到冰上，再放入 -20°C 保存。

( 2 ) 对于根部组织，从茎部下面切一寸的根，摇晃根部并迅速放入水中洗掉泥土，连续洗 3 次，然后再迅速放入塑料袋里速冻或放在冰上暂时保存。

( 3 ) 称取 2.5 g 速冻的根及叶组织，除去多余的茎及其他杂质，用预冷的剪刀将 这些组织剪成小碎片，放入预冷的研钵中，在液氮中磨碎。

( 4 ) 将这些研碎的根叶组织放入 40 ml 离心管中，用 25 ml 悬浮缓冲液悬浮这些粉末，用力摇晃混合，放 -20°C 保存 45 min，再摇，35000 g 离心 15 min。

( 5 ) 除去上清液，不搅动沉淀，用相同体积的 EDTA 水溶液洗沉淀（见注释 1) ，放冰上 3~4 min。35000 g 离心 15 min，至少再洗两次，直到沉淀不再是绿色。

( 6 ) 沉淀冷冻干燥，直到变成灰褐色。它含有蛋白以及细胞壁和纤维等其他物质。

3.2 从 TCA/丙酮粉末中制备蛋白样本

( 1 ) 称取 15 mg 的 TCA/丙酮粉末（15. 3.1 中制备好的沉淀），放入 1.5 ml 的离心管。

( 2 ) 向每一个离心管中加 1 ml 的 100 mmol/L Tris-HCl  ( pH 8.5 ) ，祸旋 1 min，18000 g 离心 10 min，去掉上清液（见注释 2) 。

( 3 ) 向每个离心管中加 1 ml 的硫脲缓冲液，从粉末中萃取蛋白质，涡旋 5 min，超声 10 min。然后在摇床中摇 30 min。

( 4 ) 18000 g 离心 10 min，取上清液。上清液中含有从叶组织中抽取的蛋白质， 浓度为 0.5~1 μg/μl。

3.3 制备 CyDyes 染料及蛋白荧光标记

( 1 ) 用新鲜的 DMF 制备 CyDyes  ( 见注释 3 ) ，因 DMF 容易氧化降解， 所以制备 CyDyes 染料时要用新鲜的 DMF。

( 2 ) 制备 CyDyes 溶液，每 1 μl CyDyes 染料中加入 1.5 μl DMF。1 ml CyDyes 溶液用来标记 50 μg 的蛋白质（见注释 4) 。由于 CyDyes 对光敏感，故需用锡箔纸包住离心管，放在黑暗中保存。

( 3 ) 每个样品吸 100 μl ( 含有 50 μg 的蛋白质）放入 0.6 ml 的离心管中（见注释 5 )，这时候样品还是分开的， 一 个样品中放入 1 μl Cy3 工作液， 另外一个样品中放入 1 μl Cy5 工作液（见注释 6)。

( 4 ) 涡旋 10s，短暂离心，重复两次。

( 5 ) 在冰上放置 30 min，避免光照。

( 6 ) 每个样品中加入 1 μl 10 mmol/L 赖氨酸来终止反应，然后在冰上放置 10 min。

( 7 ) 每 100 μl 荧光标记的样品加入 250 μl IPG 缓冲液，终体积为 450 μl ( 见注释 7 ) 。

3.4 第一向蛋白质分离：等电聚焦

( 1 ) 将 Bio-Rad 聚焦托盘放入 Bio-Rad 的聚焦室内。吸取样品放入中间的托盘内，避免气泡产生。

( 2 ) 用镊子去掉 IPG 干胶条的塑料皮，放入托盘里，确保阳极连着托盘的阳极 ，阴极对着阴极，仔细抬高胶条的一端，放下胶条的另外一端，确保整个胶条都能被缓冲液浸泡，还要确保没有气泡产生。

( 3 ) 用矿物油覆盖胶条，防止通电时胶条变干。

( 4 ) 通常完全聚焦需要最少 67000 Vh。

a. 推荐程序：水化 50 V 12 h，500 V 1 h，1000 V 1 h，8000 V 9 h，100 V 5 h。

b. 第一步为水化，不能少于 12 h，由于 Cy 染料对光敏感，所以聚焦托盘应该覆盖避免光照，或者整个仪器放在黑暗房间中使用。

c. 最后一步是移除窗口，胶条在这期间能够取出。低电压确保胶条能够完全聚焦，直到从托盘中取出。

3.5 SDS-PAGE 二向凝胶的准备

( 1 ) 低荧光玻璃板减少背景的干扰。

a. 为了扫描时易于操作，玻璃板凝胶接触的一面要涂抹亲和硅烷。为了凝胶好剥离 下来，凝胶接触的另一面要涂抹剥离硅烷。

b. 用 Milli-Q 超纯水和纸巾擦拭低荧光玻璃板不接触胶的那面，用乙醇和纸巾再擦拭一遍。

c. 每次加 0.5 ml 亲和硅烷工作液到不接触胶的那面，用纸巾使之均匀分散，直到每块板总的工作液有 1 ml。

( 2 ) 先用乙醇擦拭玻璃板，接着用水擦，逐渐加入 0.5 ml 剥离硅烷直到每块玻璃板都抹上了 1 ml 的剥离硅烷，干燥 5~10 min，除去多余液体。

( 3 ) 将玻璃板放在干净的地方干燥至少 3 h，注意亲和硅烷和剥离硅烷处理的玻璃板要分开放置。在灌胶前用氮气吹走玻璃板上的灰尘。

( 4 ) 将纸质圆点标记放于用亲和硅烷处理过的那面。每一个标记应当放在离板边缘约 1.5 cm 的短边的中点。根据编号系统，标记也应当放置在板边缘约 1.5 cm 处的底部。这样可以在随后的每一个处理步骤中区分不同的凝胶。

( 5 ) 12.5% 凝胶的制备（总共 900 ml，可以灌 12 块胶）：281 ml 40% 丙烯酰胺储液，225 ml 1.5 mol/L Tris-HCl pH 8.8，376 ml Milli-Q H2O，9 ml 10% SDS，9 ml 10% 过硫酸铵，125 μl TEMED。先将丙烯酰胺、Tris-HCl、Milli-Q H2O 和 SDS 放入大烧杯中彻底混合，再过滤这种混合物（0.2 μmol/L ) ，然后放入一个贮存器中，贮存器通过一个蠕动泵和灌胶室连接。

( 6 ) 打幵搅拌器，迅速加入过硫酸铵和 TEMED  ( 15s 内），打开蠕动泵。

a. 当几乎所有的混合液被泵入时，打开混合器侧面让尽可能多的混合液泵入。

b. 在空气进入管道前，加入置换液到软管室。

c. 继续缓慢灌胶，直到 12.5% 的溶液刚好低于不接触胶板的顶部。