Celigo技术在基因治疗和病毒研究中的应用（一）
Biogen于1978年由几位著名的生物学家，包括爱丁堡大学的Kenneth
Murray、麻省理工学院的Phillip Allen Sharp，以及哈佛大学的Walter Gilbert和Charles
Weissmann在日内瓦成立。后来，Walter Gilbert和Phillip Allen Sharp先后荣获诺贝尔化学奖和生理医学奖。
虽然在这次COVID-19疫情期间Biogen公司以另一种方式被人们熟知，但依然不影响其作为神经科学的先驱者在基因治疗领域的重要地位。
本文重点介绍并全文翻译了Biogen公司的生物检测和基因治疗团队于2019年发表于Molecular Therapy: Methods
& Clinical
Development的研究论文。研究者们为了提高日常病毒滴度检测中蚀斑实验的速度、通量、灵敏度以及稳定性，将荧光检测方法与自动图像计数相结合，并予以优化。文章以通俗清晰的笔触描述了研究团队开发和评估这一革新方法的全过程，并借此向广大病毒学、基因治疗和疫苗开发领域的相关工作者推荐。
综合荧光检测和基于图像的自动计数方法提高蚀斑实验的速度，灵敏度和可靠性
Abstract
蚀斑实验（plaque
assays）用于测定病毒样品的感染滴度。这些实验通常需要很多天来完成且通量较低。同时，肉眼识别和手工计数蚀斑非常耗时和费力，并且结果很可能还会受人为偏见和主观判断的影响导致分析人员之间的差异。同时，该实验必须为期数天，使蚀斑增长到足够大的尺寸以便适合于人工鉴定。这里，为了提高蚀斑实验的灵敏度和速度，我们整合了荧光检测和自动蚀斑计数的方法。首先，我们用荧光标记的抗体对蚀斑进行染色；其次，我们采用了一种基于多孔板的细胞图像分析仪，从而实现了无偏见、非主观的自动蚀斑计数。这两种技术的整合使得实验时长缩短了40% （从原来的5天减少到了3天），这是因为蚀斑的大小、信噪比和肉眼可见度已不再是制约因素。这种优化了的蚀斑测定方法更加灵敏，快速、稳定，同时也更加拓展了测定蚀斑形成的应用和通量。
关键词：蚀斑实验，自动计数，荧光检测，测定可靠性，基于图像的计数，基因治疗
Introduction
基因治疗是一个在研究和临床试验中提供治疗性基因的良好平台。腺相关病毒（AAV）基于其有效性和良好的安全性，是将这些治疗性基因导入至靶细胞的一种极有力的载体。AAV是一种非囊膜病毒，包括一条被蛋白质外壳包裹的基因组单链DNA（ssDNA）。AAV可以通过多种方法生产，包括瞬时转染人胚肾（HEK）细胞，使用哺乳动物工程细胞株、杆状病毒感染的昆虫SF9细胞，或诸如单纯疱疹病毒（HSV）等辅助病毒转染的稳定细胞株。因为重组AAV（rAAV）载体是有复制缺陷的，所以它们需要包含辅助功能的质粒或辅助病毒（例如腺病毒或HSV）进行复制。
在感染过程中，当AAV进入细胞核时，ssDNA变成双链（ds）的形式。该dsDNA是基因表达所必需的。如果没有辅助病毒，AAV会以潜伏形式保留在细胞中。但是，当存在辅助病毒时，带有目的基因的AAV就可被活化生产。由于最理想的rAAV的生产可以依赖于所用辅助病毒的浓度，因此辅助病毒的感染滴度是建立高效高产rAAV生产过程的关键因素之一。
腺病毒载体（adenovirus）不但是基因治疗有力的工具，更是抗病毒疫苗开发的重要手段之一。腺病毒是一个正20面体形状的病毒，将一段新冠病毒基因，如S抗原，传递进入该病毒后，20面体上会出现类似新冠病毒的刺突。腺病毒本身毒力很弱，因此可以利用它把新冠病毒的刺突抗原带入体内激发免疫应答。近日，军事医学研究院生物工程研究所与天津康希诺生物股份公司联合团队合作的重组新冠疫苗就是利用这一原理开发的，并于上周率先获批临床，在武汉市开展I期试验。合作双方作为Cellometer胞计数仪多年用户，Nexcelom公司深感使命光荣。小编获悉，研究团队已于武汉前方抗疫奋战近两个月，Cellometer胞计数仪也正用于疫苗临床评价中的细胞免疫检测环节。
有许多方法可以测定病毒基因组和感染颗粒的数量。病毒基因组滴度可通过RT-PCR，qPCR和Western
blot等技术对DNA或蛋白质进行实验性测定而获得；也可以利用衣壳蛋白滴度ELISA，流式细胞仪或市售病毒计数器对完整的病毒颗粒进行定量。最后，如HSV病毒，可以使用功能实验方法对病毒进行定量，例如常规的蚀斑实验（plaque
assay）或细胞病变效应（CPE）实验。尽管蛋白质和颗粒计数器的检测快速且定量，但它们无法提供有关病毒的传染性或功能性的信息。
病毒滴度检测是病毒学研究中最重要的步骤之一。病毒的滴度用来表示样本中病毒的含量。病毒滴度的高低与活跃病毒的感染力（infectivity）强弱相关，因此也被用作临床病毒感染中的治疗监测。实验中的病毒滴度通常测定病毒颗粒在特定细胞类型或动物中复制的能力。常用的检测方式有蚀斑实验（plaque
assay）、灶斑形成实验（focus formation assay）和终点稀释实验（endpoint dilution assay）等。
细胞病变效应（cytopathic effect，
CPE）常被应用于镜下可观察到的病毒介导的（单层）细胞恶性变化。这些细胞形态改变包括细胞膨胀或收缩，细胞变圆、分散、聚团、裂解等，以及合胞体（syncytia）或胞内内涵物（inclusions）的形成。病毒感染导致的单层贴壁细胞裂解消失是最常见的CPE类型。若局部细胞可裂解形成肉眼可见的不连续的“空洞”，即为蚀斑。根据病毒类型的不同形成人眼可见的蚀斑通常需要3-14天。同时，宿主细胞、培养基的类型和pH都会影响形成蚀斑的大小和数量。
