法医DNA检测技术的现状及展望

2018年8月08日 10:24:48 来源: 中国知网
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法医DNA检测技术的现状及展望

庞晓东 陈学亮 荣海博 俞丽娟 管桦 张涛

公安部第一研究所

DNA检测技术的应用,为法医学带来了一场技术革命。通过对遗传物质DNA的序列多态性及长度多态性的检验,即可实现个体识别及亲权鉴定,该技术正在成为当前法医物证鉴定最主要的技术手段。以法医DNA检测技术的产生、分类为纲,综述了我国在该领域的研究现状,最后对法医DNA检测技术的发展方向进行了展望。


一、 引言

十年前的5月7日,中国民航北方航空公司一架麦道82飞机在大连附近海域坠毁。在善后处理中,曾有以下报道:

“空难者亲属最关心的问题就是尽快辨认亲人。为了保证辨认准确无误,所有打捞上来的遗体的肌肉颗粒样品和空难者家属的血样都以最快的速度送到沈阳进行DNA鉴定。检测相当复杂,首先提取DNA,然后进行体外克隆放大识别其特征,之后再进行DNA数字化处理,输入计算机比对,最后找出遗体和其家属之间的DNA对应关系,才能最后确定遗体的身源……”

报道中提到的“DNA鉴定”就是被公安机关称为侦查破案“剑之锋刃”的法医DNA检测技术。人体细胞中含有约30亿个碱基对的DNA,每个人的DNA都不完全相同,不同的碱基对数目达几百万之多,因此通过分子生物学方法显示的DNA图谱也因人而异。法医DNA检测技术就是通过对遗传物质DNA的序列多态性及长度多态性的检验来进行法医学的个体识别及亲权鉴定。如今,该技术在侦查破案、查找被拐卖儿童和无名尸源、死亡案件个体识别以及证实犯罪等方面发挥了显著作用,已成为法医物证检验的常规技术, 为打击违法犯罪提供了强有力的武器。

二、法医DNA检验的科学基础

法医DNA检验技术的研究和分析对象主要是生物体内DNA的多态性。一般来说,基因或非编码区的DNA标记在染色体上的位置称为基因座,而位于同一个基因座上不同序列的基因被称为等位基因。DNA多态性就是指作为遗传标记的基因座存在多个等位基因,分析基因座上等位基因的差异就是实现同一认定的生物学基础。

人类基因组DNA多态性源于基因组DNA中的碱基突变,变异后的基因遗传给子代,显示出DNA分子水平上的个体差异。DNA多态性可分为两类:一类表现在特定基因座上相关序列长度上的个体差异,叫长度多态性;另一类表现在特定基因座上碱基序列的个体差异,叫序列多态性。长度多态性多存在于基因组DNA中的一类串联重复序列,其串联重复单位(核心序列)数目在人群中存在较大差异,具有高度多态性,称此重复为可变数目串联重复序列(VNTRs);根据重复单位长度,分为二类:重复单位长度为10~70bp,称为小卫星;长度为2~6bp的,称为微卫星,或叫STR。

按孟德尔遗传规律,子代DNA的特定序列来自双亲, 即在同源染色体中,位于同一位置上的两个等位基因,一个从母亲处继承,另一个从父亲处继承,这两个等位基因可相同也可不同。这种符合孟德尔遗传规律、具有个体特异性的DNA多态性便是进行个体识别和亲子鉴定的理论基础。

三、 法医DNA检验的技术方法

法医DNA检验技术经历了多位点DNA指纹图分析技术、扩增片段长度多态性分析技术(AMP-FLP)、线粒体DNA检测技术三大技术革命。目前已发展到以荧光标记多基因座STR复合扩增检测技术、线粒体DNA检测技术和SNP分析技术为主导的技术体系。

(一)DNA指纹图分析技术

“DNA指纹”或DNA分型(图谱)由英国遗传学家Alec Jeffreys在1985年首次提出,是出现最早的一种法医DNA技术。DNA指纹属于限制性片段长度多态性标记(RFLPs)。利用可以识别和切断特异DNA序列的限制性内切酶,将人类DNA切割成不同长度的DNA片段,经电泳分离后,用Southern印迹将酶切片段转移到尼龙膜或硝酸纤维膜上,用带有荧光或放射性同位素标记的特异性探针进行杂交,检测出不同长度的DNA片段,即得到该限制性内切酶及特异性探针的DNA图谱。DNA指纹图技术根据所使用的探针不同可分为多位点与单位点,其主要差别是多位点探针由于同时检测多个位点,DNA指纹图谱谱带多,形成的多基因座RFLP图谱被称为DNA指纹;而单位点探针由于检测单个位点,DNA图谱只出现一条带(纯合子)或两条带(杂合子),通常将这种单基因座RFLP图谱称为DNA纹印。DNA指纹虽然可以进行同一认定和判定亲权关系,但却存在着一些局限性,如方法繁杂、周期长、实验条件高等,这些局限性的存在使得DNA指纹技术不太符合司法鉴定的要求,故没有得到更大的发展与普及。

(二)扩增片段长度多态性分析技术

1985年,美国Cetus公司的Mulis.KB等人创立了聚合酶链式反应(PCR)技术。该技术是一种快速的体外扩增特殊DNA序列片段的技术,它能在短时间内复制成百上千的目标DNA序列,获取足够量的特异性片段,以供DNA的进一步分析。该技术根据VNTR基因座侧翼序列,设计、合成与侧翼互补的寡核苷酸作为PCR引物,应用PCR技术扩增包含VNTR基因座侧翼和重复单位的序列,最后通过凝胶电泳分离不同片段长度的扩增产物,根据扩增片段长度差异确定其基因型。因此,这种用PCR技术检测VNTR基因座多态性的技术被称为扩增片段长度多态性(AMP-FLP)分析; 它充分发挥了两个优势:一是基因组VNTR基因座具有高度多态性优势,二是PCR快速、高效扩增的优势。AMP- FLP分析是20世纪90年代法医DNA分析技术的一项突破性进展,使DNA分型实现了高效、快速、灵敏的目标,被称为第二代DNA分型技术[2]

法医学鉴定应用AMP-FLP具有以下几个特点[3]: DNA需要量少,检测效率高,适用于陈旧、降解、腐败检材;可进行多个基因座复合扩增检测;具有种属特异性;能进行混合检材的个体识别;可获得不连续的等位基因频率; 实验周期短,可靠性好,重复性高;操作相对简单。但该技术也存在着一些缺陷,如VNTR扩增片段长度相对较长,灵敏度较STR低;等位基因片段间长度相差很大,易产生较小等位基因优先扩增现象;若DNA严重降解,较大的等位基因可能扩增失败等。

(三)荧光标记多基因座STR复合扩增检测技术

1988年,Saiki等人首次发现人类基因组存在一些短串联重复片段(STR),这些序列能用PCR扩增且具有高度多态性[1]。STR位点因其PCR产物片段长度短、DNA分子组成结构简单、PCR反应中引物与模板退火温度相似等特点,为对多个STR位点复合扩增检测提供了条件。90年代中后期,随着现代化DNA检测设备DNA测序仪的问世,使应用荧光染料标记引物的方法对多个STR位点同步检测分析成为现实。这种检测技术通过同时检验多个STR位点获得足以认定个体的遗传信息,被称为荧光标记多基因座STR复合扩增检测技术[4]。该技术首先在扩增引物上附上荧光发光基团, 当带有发光基团的DNA片段经过激发光照射区时发出对应波长的荧光,该荧光光谱信息被光电检测器采集后,由电子系统及计算机进行储存并处理。通过比对样品光谱信号与标准比对品(标准比对品是一系列大小不同但长度已知的DNA片段)信号出现时间,计算出相应DNA片段的长度大小,从而得到检测结果。然后,根据荧光的光谱范围,检测结果参照所扩增位点的全等位基因混合物,就能知道所检测到的DNA片段等位基因命名,记录下来就是该样本在该位点下的DNA分型。

STR基因座具有以下适宜于法医DNA检验的特点: STR多态性基因座数量多,片段长度一般小于400bp,易于扩增,适于微量检材的检验;等位基因大小比较接近,较小等位基因优先扩增不明显;不同位点的STR基因座片段长度差异较小,便于复合扩增,提高检测效率。此外,STR基因座分析方法简便、判型准确,分型程序明确、规范,所得分型结果图形简单,便于实现DNA分型标准化和自动化,便于分型数据的计算机储存、联网检索。目前,STR技术已经是法医学中应用范围最广泛,使用频率最高的DNA分型技术[5]

(四)线粒体DNA检测技术

线粒体DNA(mt DNA)是人类第二套基因组DNA,其突变率较高,且多集中于D环区中的高变区域,无母系亲缘关系个体间线粒体DNA高变区碱基组成序列差异显著,集中对该高变区进行序列测定即可达到对检材的个体来源认定。它由母系遗传,已有数据表明,四代之内所有母系亲属的线粒体序列相同,因此可用于母子鉴定[6]

检测线粒体DNA的多态性需用测序技术,法医DNA实验室最常用的是荧光染料标记全自动测序技术:利用DNA聚合酶对样品DNA进行PCR扩增,采用标记引物或标记终止物双脱氧核苷酸的方法使扩增产物带上荧光,在全自动测序仪上检测,从而得到所测序列的碱基排列顺序。

由于人体的每个细胞中均有含有成千上万的线粒体细胞器,因此其内部的DNA拷贝数比核DNA多许多倍,在检测上具有更高的灵敏度。其闭环结构具有抵抗降解能力。因此,可以进行陈旧、腐败检材的检测;在一些角化的细胞,如毛干、指甲等含有角化的细胞,细胞核DNA大部分已降解,前述各种检测方法已无法检测,但线粒体仍然存在,线粒体DNA检测技术可以实现这类检材的人体遗传分析与亲子鉴定,这是该技术的最大优点。但在法医检验中还存在以下问题[7]:由于其灵敏度高,增加了污染的危险性,需要严格控制污染;由于其为母系遗传,不能区分开来自同一母系的个体和进行父权鉴定;其序列分析方法复杂、繁琐,工作量大,费用昂贵、出错率高。

(五)单核苷酸多态性(SNP)分析技术

单核苷酸多态性是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性,这种变异可由单个碱基的转换或颠换所引起,也可由碱基的插入或缺失所致,但通常所说的SNP并不包括后两种情况。它是人类基因组中最常见、分布最广泛的DNA多态性类型,占所有已知多态性的90%以上。虽然SNP多态信息不如多等位基因的STR (SNP只有两个等位基因和三种基因型),但分布的高密度性弥补了这一不足。SNP是一种早期突变,较STR等多态性遗传标记具有更高的遗传稳定性。因此,SNP可用于人类起源、进化、迁移的研究,也非常适用于法医个体识别和亲权鉴定。SNP比重复序列更易进行PCR扩增,而且没有基因漏扩和影子带现象,有利于基因分型。由于SNP是二态的, 易于自动化批量检测,易于计算机分析结果、确定基因频率。因此,SNP尤其适用于高度腐败、降解、陈旧的法医生物检材,一些学者将其称为第三代分子标记[8]

SNP的检测方法很多,在众多方法中,对待检测片段进行直接扩增、测序是最为准确的方法。近年来随着技术的发展,采用了微阵列DNA芯片[9]、飞行质谱分析和变性高效液相层析法等非电泳分型技术,大大加快了SNP检测效率。

以上技术方法奠定了法医DNA检验分析的坚实基础, 随着各种新检验技术的逐步建立、遗传标记的渐次增加、提供信息类型的扩大、涉及理论的更加深入和完善,法医DNA检测技术将会持续不断地得到发展。

四、 我国法医DNA检验技术的发展

我国法医DNA检验技术的研究基本与国际同步,自1985年国际上首次报道DNA指纹技术应用于法医鉴定以来,公安部物证鉴定中心等国内相关单位便开始了此项研究。“七五”后期,我国首次把DNA指纹技术应用于办案,开启了我国法医DNA检验的新时代。“八五”期间,我国紧跟国外发展,建立了检测DNA扩增片段长度多态性[12]和测定人类线粒体DNA序列多态性的方法;“九五”期间,商品化DNA检验试剂盒和自动测序仪的出现,一次即可完成16个STR多态性位点的检验,大大提高了个体识别率,达到了同一认定的水平。与此同时,我国开始研制国产DNA检验试剂盒;“十五”期间,公安部物证鉴[13]定中心成功研制了国产DNA荧光试剂盒,推动了STR技术在公安一线的普及应用;“十一五”期间,公安部物证鉴定中心和公安部第一研究所分别开展了疑难检材检验研究、提取技术与试剂研究、法医DNA专用检测设备研究、DNA分析软件研究和检测消耗品的研究。这些研究大大推进了我国法医DNA检测技术的发展,使我国的法医DNA检测技术进入了世界先进行列。

五、 法医DNA检验技术的发展展望

人类遗传标记已经从第一代的限制性酶切片段长度多态性(RFLP)系统、第二代的短串联重复序列(STR)系统,发展到第三代的多态性标记单核苷酸多态性(SNP)系统。其中,第一代遗传标记由于其检测流程操作繁琐,方法难以标准化,在法医学上已趋于淘汰[14]

STR是法医DNA鉴定中最为常用的遗传标记。常染色体STR复合荧光多重PCR分型技术已经成为一项国际法医学界不可或缺的、公认的重要亲权鉴定技术手段并已积累了成熟的经验。我国采用STR检验技术,建成的全国DNA数据库的DNA数据量已超过1700万份。然而STR、SNP等经典遗传学标记在同卵双生子的法医学个体甄别、二联体亲权鉴定等案例中具有一定的局限性,且STR基因座存在着较高的突变率[15]。上述问题促使法医物证工作者致力于寻找新的更为稳定的遗传多态性标记。目前,正在研究的可用于法医学的遗传标记除SNP外,还有插入缺失多态性标记(In De l)、Alu重复序列、DNA甲基化表观遗传标记等。

( 1) In Del作为一种特殊的二态性遗传标记,与SNP具有相近的自然突变率,其突变率显著低于STR。同时,In Del的两个等位基因表现为片段长度多态性,使其可以采用目前法医DNA鉴定领域常用的复合荧光多重PCR联合毛细管电泳分型技术进行分型检测,因而成为法医DNA鉴定关注的热点[16]。国内赵书民等成功建立了一个包含30个In Del位点和Amelogenin性别鉴定位点的复合荧光多重PCR扩增体系In Del_typer30,为In Del标记在中国人群中的应用奠定了一定的基础[17]

(2)Alu重复序列是灵长类动物基因组中短散在重复序列(SINE)家族的一员[18],Alu是人类最活跃的遗传元件之一,从灵长类动物进化的早期开始,Alu元件通过逆转录转座机制在基因组内快速扩增,目前在单倍体基因组中重复高达100万次,约占整个基因组的10%以上[19]。由于这种DNA序列中含有限制性内切酶Alul识别的序列AGCT,所以称为Alu重复序列。典型的人类基因组Alu序列长282bp,由两个同源但有差别的亚基构成。在所有已知的基因内含子中,几乎都发现了Alu序列。基于Alu元件的普遍性、多样性和特异性,在法医学领域,根据Alu元件的特点设计了众多的技术方案,用于DNA定量、种属鉴定、种族鉴定、性别鉴定、亲子鉴定、全基因组扩增等[20,21]

(3)DNA甲基化是一种重要的表观遗传标记。新近研究[22]表明,DNA甲基化在二联体亲权鉴定、同卵双生子法医学个体甄别等可能有一定的应用前景,可作为STR或SNP等经典遗传标记的有效补充。目前基于甲基化敏感的限制性核酸内切酶、重亚硫酸盐转化以及甲基化Cp G结合蛋白等原理,已建立一系列的DNA甲基化检测方法,在法医学实验室具有一定的应用前景。通过对基因组范围内的DNA甲基化扫描分析,科研人员正在研究具有潜在法医学应用价值的DNA甲基化位点,有望依据甲基化的SNP位点进行个体识别,并减少所需要的SNP位点数[23]

以上这些新的法医DNA检测方法,由于还缺少系统性的研究和成熟的应用体系,目前仅作为常规STR基因分型的补充检验技术,用于弥补STR检验中存在的不足。其中的SNP和In Del多态性检验技术,由于其本身的二态性特点, 更加适合DNA芯片等小型设备的检验,伴随着第二代、第三代测序技术的迅速发展及相关标准和体系的建立,其检验时间有望大幅缩短,对应的检测设备将更易于便携,因此有望成为法医DNA检测的下一代主流技术。

目前,DNA片段长度多态性检测的STR技术仍是当前国内外法医DNA检测的主要手段。STR技术至少在今后5年内还将保持技术主导地位,主要是因为:a. 技术原理成熟稳定;b. 相关技术资源丰富;c. 现有各国DNA数据库均依此技术建立,库存数据量巨大且在持续递增,技术更替成本巨大;除非能得到与现有技术一致的结果,否则一系列新的遗传标记或新的样本分析模式要取代现有大规模数据库中的数据,必须具有明显的优势和更低的成本。随着法医DNA检测装备的小型化、智能化,在现有大量STR DNA数据库的基础上,结合本文所述其它法医DNA检测技术, STR技术将进一步成熟和完善。当前,法医DNA检测方法和对应的检测设备、试剂、耗材的研发将是法医DNA检测技术研究者面临的两大主要任务,二者相互支撑,共同促进法医DNA检测技术的持续发展。





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