转基因小鼠模型的建立(SOP)-5

4．显微注射

（1）导入DNA的制备：显微注射首先涉及导入DNA的制备，显微注射的转入基因通常为去除载体序列的线状DNA，转基因所用载体是真核表达载体，即含有在哺乳动物细胞内表达的真核启动子。所谓组织特异性的实现多是通过组织特异性启动子来实现组织特异性表达的。制备转基因小鼠，必须对待导入DNA进行分离纯化。实验必须用经过琼脂糖电泳鉴定并确定其纯度的DNA，对导入基因的大小没有特别的限制，长链DNA也可成功。 实验中注意防止一些杂质堵塞注射针，如琼脂糖颗粒、纤维物质等，需尽量超速离心除去。

DNA的注射质量是实验成功的关键。研究表明DNA注射的起始浓度大约在1ng/ml，当DNA注射浓度超过一定上限时，实验效果不佳，而且大于5 ng/ml会产生明显的毒性作用。

导入DNA的制备程序如下：

1）  通过在Tris/acetate/EDTA缓冲液中进行琼脂糖凝胶电泳从载体中分离待插入DNA，用5mg/ml溴乙啶染色。

2）  为防止对插入DNA的溴乙啶的破坏，用长波紫外光显影。

3）  切下目的基因所在凝胶片，电泳制备目的DNA，或用Qiaex凝胶抽提试剂盒进行抽提。

4）  乙醇沉淀目的DNA。在样品中加入1/10体积的3M乙酸钠，混匀，再加入2-2.5倍体积无菌100%乙醇进行沉淀。

5）  -200C 孵育过夜后，超速离心机10000转/分，离心5分，收集沉淀，重悬沉淀于Elutip缓冲液。

6）  用Elutip-D微型柱对目的DNA过柱处理。

7）  按照步骤4重新沉淀DNA，用70%乙醇漂洗沉淀2-3次，真空干燥沉淀。清洗与干燥过程极其重要，因为残余的盐和乙醇对受精卵的发育是致命的。

8）  注射缓冲液（10 mmol/L Tris-HCl/0.1 mmol/L EDTA, pH 7.5）重悬沉淀，缓冲液必须是Milli-Q纯化水配制

9）  通过荧光光度计或凝胶电泳比色法评估目的DNA的浓度

10）  用注射缓冲液调整目的DNA的浓度在5-10ng/?l.

（2） 器械准备

[注射针的制作]

注射针是内含玻璃细丝的薄壁毛细吸管，它可以通过毛细管虹吸作用进行载样。用拉针仪（SUTTER,P2000 laser based micropipette puller,具体操作程序详见产品说明书）可以把注射针水平或垂直扯下来。必须保证制备的毛细管可以进入拉针仪这样加热组件大约在毛细管的中央位置。一般用内径为1.0mm的微电极管为材料制作注射针,微电极管可以买到,它与拉针仪是匹配的。另外，应该对拉针仪的设置进行选择，使细丝温度和扯拉力度(主拉力和次拉力)将处于最佳状态。具体需要预实验来确定其最佳设置。待用注射针应该用蒸馏水严格清洗以除去残留炭化物颗粒。严格的实验微电极管在使用前应经过泡酸、泡蒸馏水和硅化的程序,但有人省略了此步也有较好的结果,经拉针仪拉针后就没法清洗,好的拉针仪是不会残留炭化物颗粒,若拉成后清洗其针尖很容易断掉,可用Narishige Japan model PN-30。

[持卵管制作]

为避免机械损伤，持卵管口应该是钝性末端而且其孔隙有限，使受精卵轻轻依附在负压管道中。这种高度密实可抵抗密封系统的破损，而密封可以减少受精卵注射时的旋转运动。持卵管的口部应该光滑，平整及与其长轴垂直。具体制备操作：双手执毛细玻璃管的两端，将管的中部置酒精灯外焰烧红至变软后离开火焰，同时双手外伸，将烧软的部分拉细。用玻璃刀或细沙轮小心将细管切开，在镜下观察切口应平齐(如不平齐，应重新切割)。然后于酒精灯火焰底部的蓝焰边缘处将切口钝化处理(即将管口于蓝焰边缘处做短暂灼烧，然后于显微镜下检查管口形状，如此反复，直至满意)。如实验室配有持卵管制作仪，则可在显微镜下直接监视热灯丝对持卵管管口灼烧后的形状，及时调整二者之间的相对位置，更易得到满意的持卵管。持卵管应该做调整，用熔断仪将其打弯使其末端成15度(不同的显微注射仪度数可能有差异,打弯成25度左右,一般为20-25度)轻微弯曲以方便使用。此持卵管为不含细丝的玻璃，显微镜下用含刻度目镜确定持卵管的外径应该为100-140?m。持卵管的内径很重要,可用铂金灯丝灼烧管口,使其内径为30-50?m左右,内径要能吸住受精卵,而又不把卵吸入管内。为便于操作，持卵管可进一步调整使其末端轻微弯曲（15度）。