用碱水解和氯甲苯活化的固定化实验
基本方案
实验方法原理 |
用这种方法酯键通过碱的处理被部分水解,用溶在丙酮中的对甲苯磺酰氯化物来活化,用羧基或羟基固定化酶到这个残基上(图 1)。
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实验材料 | 酶溶液 |
试剂、试剂盒 | 磷酸钾 NaCl NaOH 丙酮 对甲苯磺酰氯化物 |
仪器、耗材 | 吸滤器 玻璃料 聚酯小片 |
实验步骤 |
实验所需「试剂」具体见「其他」 1. 通过氯化物的碱解和活化 聚酯小片(每片 2 cm2,10 片)在室温 10 ml 10%(质量浓度)NaOH 中孵育 10 min,其后聚酯在玻璃料上被充分冲洗和吸干,用水冲三次,再用丙酮冲五次,每次 10 ml。 冲洗后尚未干,小片立即转移到 10 ml 溶有 100 g/l 甲苯磺酰基氯化物的丙酮中孵育 20 min。其后在玻璃料上用丙酮冲洗三次、水冲洗三次、pH 7.5 的 0.1 mol/L 磷酸钾两次,每次 10 ml。 2. 酶的固定 冲洗之后迅速添加酶溶液(大约 10 ml,聚酯小片必须完全沉浸)并在 4℃ 温和的摇动中过夜。未结合的酶在吸滤器或玻璃料上先用溶有 0.5 mol/L NaCl 的 pH 7.5 0.1 mol/L 磷酸钾冲洗,再用 pH 7.5 0.1 mol/L 磷酸钾来冲洗,其后,储存在缓冲液中,为了储存更长的时间,可用水冲洗去除聚酯小片上的缓冲液,并在空气中干燥。
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注意事项 | |
其他 |
试剂: 0.1 mol/L pH 7.5 磷酸钾 溶有 0.5 mol/L NaCl 的 0.1 mol/L pH 7.5 磷酸钾 100 g/L NaOH 丙酮 溶有 100 g/l 对甲苯磺酰氯化物(Mr=190.7)的丙酮
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