高致病性冠状病毒感染成了这十年来广受关注公共卫生问题。严重急性呼吸综合征（SARS，2002-2004），中东呼吸综合征（MERs，2012-至今），2019-nCov（COVID-19），每一个对人类健康，经济发展都带了巨大的冲击。

　　病毒通过接触，飞沫，气溶胶等形式，引起广泛传播，引起高感染率。虽然SARS和MERS最初表现为轻微的流感样疾病，并伴有发烧、呼吸困难和咳嗽，但进展到更严重的症状是非典型间质性肺炎和弥漫性肺泡损伤。他们都能引起急性呼吸窘迫综合征（ARDS），这是急性肺损伤中最严重的一种，50%的ARDS患者肺泡炎、肺炎和缺氧导致呼吸衰竭、多器官疾病和死亡。

　　COV特别令人关切的是，病例死亡率高，缺乏经验证的治疗药物，以及这些病原体迅速跨越地理和地缘政治边界进入其他国家和大陆的种子爆发能力。

　　冠状病毒科

　　高致病性冠状病毒SARS-CoV和MERS-CoV最近出现在人类群体中，但包括HCoV-oc43、HCoV-229e、HCoV-nl63和HCoV-hku1在内的其他人类冠状病毒估计已在人类群体中传播了数百年，导致轻度呼吸道疾病，其中约5-30%的“普通感冒”。

　　在冠状病毒科（nidovirales）中，有四个属被鉴定：alphacoronavirus，betacoronavirus，gammacoronavirus和deltacoronavirus 。

　　目前鉴定的几种人HCoVs属于alphacoronavirus（HCoV-229e和HCoV-nl63）和betacoronavirus（SARS-cov、MERS-cov、COVID-19，HCoV-OC43和HCoV-HKU1）。gammacoronavirus和deltacoronavirus没有已知感染人类的病毒。

　　泛冠状病毒药物发现的体外研究系统

　　反向遗传学系统

　　高致病性冠状病毒和潜在泛冠状病毒药物候选药物的研究进展，部分依赖于基因操纵CoVS的技术，以探讨病毒发病机制和抗病毒药物活性。

　　反向遗传学系统可根据已知的病毒序列合成病毒。因为传染性病人样本收取、分离、运送等限制了大多数实验室对临床分离病毒的获取和使用。反向遗传学系统为研究病毒的发病机制和模型开发提供了必要的研究材料。

　　在SARS大流行之前，通过系统地将cDNA盒组装成全长的传染性克隆，可以对病毒基因进行精确和有针对性的遗传操作，已经开发出了强大的反向遗传学系统来操纵CoVs的基因组。

　　感染性克隆允许创造近同质的病毒种群，而传统的病毒种群是通过放大细胞培养来制备的。除了重建covs的流行株外，反向遗传系统还允许将突变靶向到特定的病毒基因，获取无传染性的组装病毒 。

　　作为一个例子，将分离特定基因突变的能力应用于SARS-CoV的Spike(S)糖蛋白的研究，同时保持病毒复制体和其他结构蛋白的等基因背景。将SARS-CoV暴发的人畜共患病、早期、中期和晚期流行病毒株的突变插入SARS-CoV（Urbani）流行菌株的s糖蛋白中，以确定进化对病毒进入人类细胞的影响，以及啮齿动物和灵长类疾病模型中病毒的发病机制。通过将突变靶向到特定的病毒基因，反向遗传学系统允许研究人员探索宿主对病毒遗传变化的致病反应的因果关系。此外，利用反向遗传学技术合成大量研究用材料，对于高通量药物筛选研究极为重要。

　　细胞研究系统

　　和所有其他病毒一样，冠状病毒需要宿主细胞机制来复制它们的基因组，产生后代病毒，并导致疾病 。

　　细胞株需要宿主细胞受体的表达以及必要的蛋白酶的表达，以促进病毒的进入。

　　冠状病毒的S糖蛋白是宿主细胞附着和病毒进入的主要决定因素，在HCoVs之间不太保守 。虽然所有已知的HCoVS都有针对人类呼吸道的病毒性取向，但还没有建立可被广泛HCOVS感染的肺细胞系。

　　SARS-CoV和MERS-CoV的一个关键特征是，高致病性冠状病毒在更广泛的细胞系中比其他轻度致病性冠状病毒HCoV-OC43、HCoV-229e、HCoV-nl63和HCoV-hku1的病毒滴度更高。

　　用HCoVs和BatCoVs感染各种动物的细胞系，有助于发现病原体的潜在宿主范围，并有助于识别参与病毒传播的易感哺乳动物宿主。但也不是对应关系，在动物体内，受体及免疫的多样性和可用性与单纯细胞系不同。原代细胞进行假复层气道上皮培养，可以模拟动物体内气道上皮细胞的复杂性，但是无法捕捉到，完整免疫系统与病毒相互作用，包括促炎细胞的浸润，这些细胞可能在最严重形式的SARS和MERS中促进ARDS。类器官可能模拟免疫细胞和病毒的相互作用，但还没有在冠状病毒应用。

　　泛冠状病毒体内研究模型

　　小动物模型

　　在2003年SARS-CoV出现后，通过给动物接种病人分离SARS-CoV，启动了小动物模型的开发，包括：小鼠、仓鼠、豚鼠和雪貂，但只有雪貂表现出感染引起的疾病迹象。

　　在小鼠的实验中，小鼠可以复制SARS-Cov，但没有引起疾病迹象，在这些模型中，病毒从肺中迅速清除。

　　多个研究小组发现在小鼠肺部连续传代，产生小鼠适应性SARS-cov，在野生型小鼠鼻内感染模型中引起致死性肺部疾病，此模型被用于药物开发。野生型自交系小鼠的SARS-CoV适应模型的益处包括通过个体小鼠的存活、体重减轻和全身多层摄影检测的可复制的疾病易感性，以及浸润细胞的定量、病毒滴度、组织病理学、转录和蛋白质组学在靶器官中的变化。

　　为了评估体内紧急病毒的发病机制，人畜共患SARS-cov和preemergent batcov突变已被纳入SARS-CoV MA15模型，为有可能出现在人类体内的病毒提供了新的动物模型。在SARS-CoV MA15模型中，研究严重Cov疾病的变量，其他有价值的因素包括年龄、剂量和宿主对疾病表型的遗传贡献。

　　用于药物发现的SARS-cov小鼠适应模型的最大局限性是将突变纳入SARS-cov基因组（特别是用于测试针对具有突变的病毒基因的抗病毒药物），以及小鼠和人类免疫反应之间的差异。

　　与SARS-CoV不同的是，MERS-CoV的人类临床病毒株没有在小鼠、仓鼠或雪貂中复制，原因是：人类DDP4与实验动物的关键氨基酸存在差异。在兔子模型中发现病毒复制，但是没有临床表现，所以少量药物研究在使用。人DDP4转基因小鼠开始被使用，类似于SARS-CoV，在小鼠肺传代产生适应性，进而产生临床表现。CRISPR/Cas9也被用于产生特定基因突变DDP4的转基因鼠。

　　灵长类动物

　　小动物模型作为冠状病毒感染的模型得到了更彻底的开发，这是由于啮齿动物容易被操纵，以及与非人类灵长类动物（NHPS）相关的成本和伦理问题增加所致。然而，高致病性冠状病毒感染的NHP模型的发展是评价泛冠状病毒治疗学的关键，因为来自NHPS的宿主免疫反应与人类相比具有更大的同源性，并且可能更准确地指示评估泛冠状病毒治疗所需的严重疾病的免疫生物标志物。

　　在NHP感染模型中观察到疾病表征与啮齿类动物SARS-CoV和MERS-CoV模型不同。从人类中分离出的SARS-COV和MERS-CoV都在NHPS中复制，可以体现对冠状病毒引起的疾病的重要方面的保护，包括呼吸道生物学、受体同源性以及宿主受体和蛋白酶的表达模式。

　　常见的SARS-CoV实验室灵长类动物，包括非洲绿猴、恒河猴、猕猴和常见的狨猴，导致了不同程度的严重程度的疾病迹象，但没有一种能反映人类所见的致死性SARS疾病，感染后急性肺组织病理学观察到最严重的疾病表型（3-6天），典型表现为肺部病变和肺炎，偶尔观察到弥漫性肺泡损伤。可以复制部分老年加重的表型和天然免疫异常变化。

　　非人类灵长类动物MERS-CoV感染模型，其中最具特征的模型为恒河猴和普通狨猴的MERS-CoV感染。注射MERS-CoV病毒，引起轻症改变，很少见可观察的疾病变化。包括注射，口服等多种形式给病毒可以引起中等程度的改变，重症模型在狨猴可见。但是多种途径，就无法体现病毒实际感染路径。同时缺乏可重复的临床疾病体征，如发烧、呼吸窘迫或致命性。

　　泛抗冠状病毒药物

　　三类靶点

　　非结构型蛋白：3c样蛋白酶（3CLpro）、木瓜蛋白酶（PLpro）和RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp）。

　　结构性蛋白：Spike（S）糖蛋白、包膜（E）蛋白、膜（M）蛋白和核帽（N）蛋白

　　辅助蛋白：病毒间变异太大，不是很好的药物靶点

　　靶向CoV非结构性蛋白（nonstructural proteins，nsps)

　　冠状病毒NSPs是冠状病毒生命周期中高度保守的成分，介导病毒复制，包括3c样蛋白酶（3CLpro）、木瓜蛋白酶（PLpro）和RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp）。

　　CoVRdRp复制病毒RNA基因组并生成病毒RNA转录本，这是细胞聚合酶无法实现的基本功能。CoV生命周期的另一个基本元素是由3CLpro和PLpro两种病毒蛋白酶将病毒多蛋白水解成功能性的nsps。

　　除了聚合酶和蛋白酶功能外，CoVs的nsps还具有其他基本功能，包括免疫拮抗、双膜囊泡组织、复制复合物、核酸结合、解旋酶活性和病毒RNA校对，这些功能可能是冠状病毒特异性抗病毒药物发现的未来靶点。

　　GS-5734瑞德西韦（Remdesivir）

　　GS-5734是一种小分子核苷类似物，靶向病毒RdRp（RNA合成酶），起到抑制病毒复制作用在体外对几个新出现的传染病的病毒家族表现出抗病毒活性，包括丝状病毒科、肺炎病毒科、副粘病毒科和冠状病毒科。

　　三个临床包括两个2019-nCov（COVID19）：

　　 NCT02818582（ GS-5734 to Assess the Antiviral Activity, Longer-Term Clearance of Ebola Virus, and Safety in Male Ebola Survivors With Evidence of Ebola Virus Persistence in Semen，National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID)

　　NCT04257656 （Severe 2019-nCoV Remdesivir RCT，Capital Medical University ，Bin Cao, China-Japan Friendship Hospital）

　　NCT04252664（Mild/Moderate 2019-nCoV Remdesivir RCT，Capital Medical University，Chinese Academy of Medical Sciences，Bin Cao, China-Japan Friendship Hospital）

　　洛匹那韦-利托那韦（(克力芝）

　　洛匹那韦-利托那韦最初是作为HIV-1蛋白酶抑制剂开发的，但在体外活性也针对SARS-CoV非结构蛋白3CLpro。在SARS-CoV流行期间，SARS患者的洛匹那韦-利托那韦联合利巴韦林治疗与历史对照病例相比，降低了病毒载量，降低了死亡或ARDS的不良临床结果。

　　在MERS出现后不久，已知抗病毒化合物的高通量筛选方法在体外鉴定了洛匹那韦对MERS-cov的活性，口服洛匹那韦-利托那韦治疗MERS-CoV狨猴模型，MERS疾病体征略有改善，包括胸部x线识别的肺浸润减少，间质性肺炎减少，体重减轻。病人治疗有阳性结果，包括退烧，血清和痰的病毒清除，以及生存有关。根据体外和体内对抗MERS-cov的活性，沙特阿拉伯一项临床，住院的MERS患者中使用洛匹那韦-利托那韦和IFN-β1b联合治疗。

　　利巴韦林

　　利巴韦林是一种鸟苷类似物，对大量高致死性新兴病毒具有体外活性。利巴韦林抑制病毒RdRp，抑制RNA合成，并抑制mRNA的Capping。然而，研究表明，虽然SARS-CoV、MERS-CoV和HCoV-oc43在体外对利巴韦林敏感，但显著抑制CoV复制的剂量，超过了人类使用利巴韦林最高浓度。

　　在小鼠模型中对利巴韦林的体内测试发现，单独使用利巴韦林对MA15SARS-CoV的活性有限，并显示利巴韦林治疗可增强SARS疾病征象。

　　然而，利巴韦林和I型干扰素在灵长类动物模型中的联合治疗改善了MERS的疾病体征。病人治疗，利巴韦林治疗高致病性冠状病毒呼吸综合征患者的疗效有限。

　　靶向cov结构蛋白和辅助蛋白

　　结构蛋白：Spike（S）糖蛋白、包膜（E）蛋白、膜（M）蛋白和核帽（N）蛋白。

　　S蛋白决定病毒细胞取向、宿主范围和病毒进入；E蛋白促进病毒的组装和释放，并具有病毒素活性；M蛋白维持病毒子膜结构；N蛋白使病毒RNA基因组化。但是研究显示部分结构蛋白去除，并不改变病毒复制能力。

　　辅助蛋白因为数量，序列，功能在病毒间差异非常大，不是很好的药物靶点。

　　单抗药物

　　针对S蛋白的单抗药物研究最多，以期阻止病毒进入宿主细胞。但是病毒会通过突变，躲避抗体药物。所以有设计单抗药物鸡尾酒以克服病毒的逃逸。也有报道，S蛋白抗体会激活病毒。

　　疫苗

　　疫苗长期以来一直被认为是针对人类群体的预防和根除传染病的金标准，并赋予个人长期免疫保护的好处。但是冠状病毒是人畜共患病，针对人的疫苗也无法根除。针对中间宿主的疫苗也在开发，针对MERS-COV的骆驼中间宿主的疫苗接种策略已经开发出来，这可能有助于抑制骆驼中的病毒复制，防止MERS-COV传播到人类，针对sars-cov开发的疫苗制剂不仅未能保护老年人群的动物模型，而且还导致年轻人群的免疫病理。所以疫苗开发有很多路要走。

　　靶向宿主

　　宿主因素调节

　　针对病毒蛋白的小分子化合物及抗体药物，病毒可以突变自己，来适应，产生耐药。因而，有研究想通过改变宿主细胞蛋白（尤其是和病毒生命周期密切相关的宿主蛋白），这样可以避免病毒突变产生的耐药。几个研究组开始针对宿主蛋白酶（弗林蛋白酶，组织蛋白酶，跨膜丝氨酸蛋白酶，这些蛋白酶是病毒通过S蛋白进入宿主所需）抑制剂。但是不同病毒通过S蛋白进入宿主细胞所需蛋白酶有差异。环孢菌素开始进入研究，展现一定效果。

　　宿主免疫调节

　　合理的利用免疫系统，肯定是抗病毒的最好出路。比如1型IFN被用于冠状病毒临床治疗。因为1型干扰素是连接天然和适应性免疫的重要桥梁。当然在细胞因子风暴出现后，抑制免疫也成为对症治疗必需做出的选择。如何使用宿主免疫调节，也是关键。