红细胞保存研究的新策略——冰冻干燥
关键词： 血细胞；保存；冰冻干燥 中图分类号 R318.52 R331.1＋41 成分血的输注在发达国家已占血液输注的90%以上，因此红细胞的保存研究倍受重视。血细胞的保存通常是在4℃条件下进行，保存时间可以有效地延续至42d。特殊情况下实行深低温保存，放在－80℃冰箱或液氮(－196℃)中长期保存［1］。这两种方法都需要低温设备，在进一步改进保存技术的研究中，冰冻干燥红细胞已成为细胞保存研究的新策略，引起了人们的关注。现将以此为主要内容的研究作一简要文献回顾。 1 血液输注和保存研究的发展史(表1)
表1 输血及血液保存研究的简史
| 年份 | 事迹 |
| 1898 | 首次将血液用于妇科病人 |
| 1900 | 发现红细胞ABO血型，并用于临床 |
| 1947 | 用ACD保养液保存全血21d |
| 1957 | 用CPD保养液保存全血28d |
| 1978 | 用CPDA-1保养液保存全血35d |
| 1980 | 用MAP保存液保存全血42d |
| 1989 | 冰冻干燥保存红细胞 |
| 1995 | 冻干红细胞再水化后进行人体实验 |
| 1996 | 深低温(－196℃和－80℃)保存红细胞28年［1］ |
| 1997 | 申报红细胞和血小板冻干ZL累积15项 |
2 红细胞冰冻干燥保存的可行性 4℃和深低温条件下保存红细胞经长期实践获得了良好效果，已经得到确认，但冰冻再加上干燥保存之后，特别是细胞能否经受得住干燥给细胞带来的损伤，再加上早期尝试冻干保存血细胞的失败的经历，容易使人们感到困惑。Goodrich［2］于1989年取得了突破性进展，用分子量为2.4万，180g/L浓度的PVP(聚乙烯吡咯烷酮)、单糖和聚阴离子化合物等制备的填加液冻干保存红细胞，使经冻干后再水化的红细胞存活率为冻干前的72.1%，血红蛋白的回收率为66.9%，初步显示了冻干红细胞的可行性。1992年，提高了人工冻干添加液中PVP的浓度(20%)，再加1 mol浓度的蔗糖，使红细胞的活存率增加到77%，Hb的回收率为76.4%［3，4］。1993年，用分子量4万的PVP和适宜的单糖等组成的添加液冻干保存细胞压积为10%的红细胞悬液，再水化后，反映红细胞携氧功能的P50为26～28mmHg，氧合Hb为正常红细胞的90%以上，同年Sowemimo-Coker等［5］采集人静脉血红细胞，CPDA-1抗凝，取部分红细胞放在4℃条件下保存7d和14d，作为对照;其余用等渗葡萄糖盐水和冻干缓冲液(cryopharmpasadena,CA)混均，用冻干机(Model 115 SRC,Virtis Co.)冻干,－20℃保存7d，用磷酸盐缓冲液-葡萄糖盐水(pH 7.4,298 m0smo/kg)再水化，自动细胞洗涤机(Model 2991,Cobe)按标准洗涤程序洗涤后分成4组：第1组供测定各项指标用,第2～4组分别用ADSOL，CPDA-1和特殊添加剂混均，继续4℃保存7d，在前7d末和后7d末，测定红细胞ATP含量和反映红细胞携氧能力的2，3-DPG等指标。结果发现，保存后冻干组和4℃保存CPDA-1组的相应指标与对照组相近，甚至更好，详见表2。 表2 人红细胞冻干保存7d(－20℃)和再水化后4℃ 保存7d红细胞各项指标的变化
| 测定指标 | 冻干保存＋再 水化* | 冻干＋再水化 4℃保存** | P |
| ATP(μmol/g Hb) | 4.39±0.55 (4.02±0.45) | 3.37±1.99 (3.53±0.40) | NS* |
| 2，3-DPG（μmol/g Hb） | 4.94±2.85 (3.14±2.02) | 0.40±0.49 (0.70±0.73) | NS |
| 乳酸盐(μmol/gHb) | 3.9±1.4 (45.9±1.5) | 17.9±13.6 (83.9±9.7) | ＜0.001 |
| MCV(fl)-细胞容量 | 90.8±4.4 (93.5±4.41) | 90.3±4.9 (95.3±4.7) | NS ＜0.02** |
| MCH(pg)-平均细胞Hb | 29.9±1.6 (31.0±1.8) | 31.3±2.2 (31.3±1.6) | NS |
| 渗透性脆性(mOsmol/kg) | 156.7±2.07 (156.7±3.27) | 155.0±5.0 (160.2±11.1) | NS |
| 氧合Hb(%) | 97.4±1.8 (99.1±0.8) | 99.5±0.6 (99.8±0.3) | NS |
| Hb(%) | 未检测 | 99.2±0.3 (99.1±0.8) | NS |
| Dimax-最大形变指数 | 0.64±0.02 (0.69±0.09) | 0.61±0.03 (0.63 0.02) | NS ＜0.007** |
| 相对滤过指数 | 0.70±0.16 (0.92±0.09) | 0.86±0.08 (0.99±0.02) | ＜0.02 NS** |
注：( )括弧内数字为对照值；两项指标冻干保存与对照组相比结果；**冻干＋4℃保存与对照组相比结果；NS实验组与对照组比较无显著性意义 1995年Weinstein等［6］报道的冻干红细胞人体输注实验，向该项研究的最终目标——临床应用迈近了一步。从4名健康(21～35岁）志愿受试者采集1U(400ml)静脉血，4℃存放过夜，再行冰冻干燥保存。给献血者回输的当天，将冻干红细胞再水化，用放射性同位素51Cr标记红细胞后，取20ml，5min输完。结果表明，冻干血红细胞回输后未见临床不良反应，体内实验，24h红细胞回收率为(85.2±2.79)%，红细胞半寿期为31.0±8.19d(正常值为25～33d)；体外检测，用流式细胞仪检测冻干前后细胞计数并计算其细胞回收率%，氧合血红蛋白，P50，红细胞渗透性脆性，变形性，ATP，2，3-DPG等见表3［6，7］。 表3 人冻干红细胞的体外和整体实验各项指标的变化
| 指标 | 新鲜红细胞 | 冻干再水化红细胞 |
| 红细胞活存率(%) | 100 | 85.2±2.79 |
| ATP(μmol/gHb) | 3.06±0.87 | 2.74±0.81 |
| 2,3-DPG（μmol/gHb) | 13.07±1.64 | 9.83±2.62 |
| P50(mmHg) | 27.88±1.18 | 27.25±1.84 |
| MCV(10－15L) | 88.10±2.44 | 90.93±2.56 |
| MCH(10－12G) | 30.73±1.88 | 29.98±0.88 |
| 氧合Hb(%) | 98.99±1.46 | 98.58±1.46 |
| 渗透性脆性(%) | 2.23±1.1 | 2.8±0.93 |
| 滤过指数 | 0.980±0.04 | 0.95±0.06 |
| 乳酸盐(μmol/gHb) | 0.97±0.19 | 0.86±0.29 |
| 循环血中24h细胞活存率 | 89.925±4.129 | |
| 循环血中细胞半寿期 | 31±8.19 |
注：体内红细胞24h活存率大于75%，保存的血液符合标准 综合上述研究结果，得到的初步结论是，冻干红细胞再水化后能够重建生物学功能，整体回输后能够维持输注正常血细胞一样的存活率和循环时间。推测冻干人红细胞可以在常温下保存5年。 3 冻干保存人红细胞的关键技术环节 3.1 冻干稳定剂的选择 为了减少细胞损伤，在冻干液和再水化洗涤液中需要加入稳定剂(冻干缓冲液、洗涤液中的大分子聚合物和碳水化合物)，红细胞冻干稳定剂文献报道各异，主要包括：①大分子聚合物，如PVP、葡聚糖、羟乙基淀粉、骨胶等；②聚阴离子化合物，如焦磷酸、磷酸化肌醇；③碳水化合物，如葡萄糖、蔗糖、木糖、甘露糖等；④磷酸盐缓冲液或钾、钠等金属离子［8～11］。其中大分子聚合物和聚阴离子化合物的选择及其分子量和在溶液中的浓度等因素，对细胞的回收率均有影响。进一步的研究证明，PVP的玻璃化转变温度受分子量和浓度的制约，即玻璃化转变温度随分子的增大而提高，随着水分的丢失(或在冻干体系中浓度的增加)而提高，冻干和保存生物样品应在保护剂的玻璃化转变温度下进行，以减少生物活性的丢失。Speiles等［12］在分析了多种保养液成分之后认为，依据玻璃化转变温度，选择大分子聚合物是适宜的，比如骨胶(gelatin)和PVP等，因为它们可以在相对高的温度下进行冰冻干燥，并可以缩短干燥时间。同时还发现，如保养液中加入盐(氯化钠)，将会随着盐浓度的增加减少PVP的玻璃转变温度的升高，因此认为应控制氯化钠的加入量。 3.2 再水化过程中使细胞膜不受损伤 为了细胞的存活，冻干过程中细胞必须处于高渗状态，所用保养液的渗透压相当于3～5倍生理渗透压，在给人体输注前需要经过逐步洗涤。将细胞悬液的渗透压调整到生理水平的过程中，容易出现细胞膜破裂，血红蛋白流出的现象。其洗涤液的配制需要深入研究，有些文献报道对此保密。 3.3 冻干过程中的温度控制 红细胞的冻干首先使细胞冰冻，由液态变成固态，然后使箱体内的细胞在抽气减压、升温的同时，水分升华，逐步达到干燥的目的。因此，冰冻、升温与真空度三者关系如何协调、控制，对冻干效果至关重要。Rindler［13，14］用20个样品进行实验，比较了－5℃～－65℃不同温度下干燥人红细胞的效果，冻干后红细胞溶解率在－35℃时溶血率最低，效果最好。也有学者实验结果显示－93℃时优于－75℃和－66℃，溶血率却均在19%以上，但冻干例数少，缺乏说服力［15］。 4 研究冻干保存红细胞的重要意义
除了民用外，在以往的战争中也主要用4℃保存血输注。海湾战争中美军用的是－80℃冰冻血，使用前融化至零上温度。使用液态血液有许多不便：如运输困难、受气温限制较大、浪费较多(越南战争时期，美国1968～1972年统计，每年供血量浪费率高达60％～65%)、输血反应多等。和4℃保存血相比，冰冻干燥红细胞最大优势是使血液由液态变成固态(粉剂)，是一种全新的存在形式，便于运输，不需要专门运输车；少受天寒酷暑影响；不存在因运输震荡溶血问题；便于长期保存；战地医院一时用不完的冻干血，可以留下来以后再用，减少浪费，总之可极大改善战时血液供应状况。因此，对伤员的救治，减少战斗减少员，提高部队战斗力具有重要意义。此外，冻干粉剂红细胞还可民用，对特殊灾害时的医疗救治也能发挥巨大作用。
参考文献
1，Sumidas,Oshikawa K.Morphological and physiology integrity of red cells cryopreserved 28 years.Cryobiology,1996,33:649
2，Goodrich RP.Lyophilization of red blood cells.United States Patent 1989,No 4，874,690
3，Goodrich RP. Medium for lyophilization of erythrocytes.United Sates Patent,1992,No 5,171,661
4，Goodrich RP,Sowemimo-Coker SO,Zerez CR,et al.Preservation of metabolic activity in lyophilized human erythrocytes.Proc Natl Acad Sci USA,1992,89:967
5，Sowemimo-Coker SO,Goodrich RP,Zerez CR,et al.Refrigerated storage of lyophilized human red cells.Transfusion,1993,33:322
6，Weinstein R,Sowemimo-Coker SO,Goodrich RP,Survival of lyophilized and reconstituted human blood cells in vivo.Transfusion Clin Biol,1995,2:427
7，Goodrich RP,Raymond P,Williams CM.Method of reconstituting lyophilized cells.United States Patent,1995,No 5,425,951
8，Goodrich RP,Raymond P,Williams CM.Lyophilization of erythrocytes.United States Patent,1994,No 5,592,340
9，Goodrich RP,Raymond P,Williams CM.Lyophilization of cells.United Sates Patent,1997,No 5,206,648
10，Spargo BJ,Rudolph AS,Chang BS,et al.Freeze dried red blood cells.United States Patent,1997,No 5,69,963
11，Crowe JH,Oliver AE,Hoekstra FA,et al.Stabilization of dry membrance by mixtures of hydroxyethyl starch and glucose:the role of vitrification.Cryobiology,1997,35:20
12，Speiles G,Heschel I,Rau G.Glass transition curve of aqueous solutions for the freeze-drying of biomaterials.Adv Cryogenic Eng,1996,41:23
13，Rindler V,Leberger S,Schwindke P,et al.Freeze-drying of red blood cells at ultra-low temperature.Cryobiology， 1999,38:2
14，Rindler V,Heschel I,Rau G.Freeze-drying of red blood cells，how useful are freeze/thaw experiments for optimization of the cooling rate?Cryobiology ，1999,39:228
15，Spieles G,Heschel I,Rau G.An attempt to recover viable human red blood cells fter freeze-drying.Cryo-letter,1996,17:43
