流式细胞仪检测技术的实验

2018年7月13日 13:22:05 来源: 互联网
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实验方法原理    
流式细胞仪的使用一般分为三个步骤。*,是仪器前阶段,包括试剂的准备,细胞制备、细胞的荧光染色;第二,是流式细胞仪阶段,主要是仪器的操作;第三,是结果分析阶段。
实验材料    淋巴细胞外周血的白细胞
试剂、试剂盒    FACS缓冲液PBS叠氮钠溶液仪器缓冲液FACS清洁液FACS洗净液
仪器、耗材    流式细胞仪
实验步骤    
一、细胞和试剂的准备

1.  细胞样品:来源淋巴细胞或外周血的白细胞。

2.  荧光标记单克隆抗体:常用的有FITC(fluorescein -isothiocyanate)和PE(phycoerythrin)标记的单克隆抗体。

3.  封闭抗体:抗Fc受体抗体
 
4.  FACS缓冲液:
1×PBS  950 ml
FCS  40 ml
10%叠氮钠溶液  10 ml

5.  仪器缓冲液(FACS-flow):仪器厂家提供

6.  FACS清洁液(FACS clean )和FACS洗净液(FACS rinse):仪器厂家提供。

二、操作步骤 
 
1.  单细胞悬液的制备:将1×105~1×107的细胞放入1.5 m l离心管中3000 r/min 离心5分钟,弃上清;加入FACS缓冲液100 μl 悬浮细胞。

2.  封闭细胞表面Fc受体:在步骤1中加入Fc受体抗体0.5 μl(0.5 mg/ml),水浴3分钟。

3.  细胞与荧光抗体结合:在步骤2中加入荧光抗体1 μl(0.5 mg/ml),水浴30分钟。

4.  洗细胞去除游离的荧光抗体:在步骤3中加入FACS缓冲液350 μl,轻轻混匀,3000 r/min,离心5分钟,弃上清,重复步骤(4)2次。

5.  上样前处理:取100 μl 仪器缓冲液加入步骤(4)获得的细胞沉淀中,轻轻混匀悬浮细胞,将细胞悬液移入FACS专用管中,准备进行仪器检测和分析。

三、仪器的操作

以FACSCaliburTM(BD Biosciences)仪器为例。仪器主要分为主机部分(包括激光激活源,射流,射线探测器)和计算机部分(CELLQuest softwere)。仪器的操作分为使用前的准备、使用中的操作和使用后的清洗。

1.使用前的准备

(1)打开电源:包括系统电源和主机部分电源。

(2)检查供液槽和废液槽:供液槽应含足够的仪器缓冲液,废液槽应在上次使用后清洗干净。

(3)使机器处于负亚状态,才能使细胞悬液被吸入至机器的吸管口。

(4)机器处于可应用状态时,指示灯会变成绿色。

2.使用中的操作

(1)计算机部分—使用CELLQuest程序系统软件:

①设定所要检测细胞的数量:一般设10 000~20 000个细胞。

②命名本次实验:一般含使用者的姓名和实验日期。

③打开记数部分:显示进入的细胞数以及检测一定量的细胞所需要的时间。

④将微机与主机连接:控制检测时的预检测和实际检测。

⑤主机设定:一般是已设定好的适合测定淋巴细胞的条件,包括探测器的电压。探测器的电压是调空光电倍增管所能检测荧光密度的范围。

⑥选择检测的波长和表达方式(plot):如果用一种荧光抗体,一般选直方图(histogram);如果用两种荧光抗体,常选点状二维图(dot plot)或轮廓线图(contour plot)表

 CD69分子表达检测直方图的数值说明
 
 
 
b.abti-CD3(2 ng/ml)检测结果
 
 
 
c.abti-CD3(10 ng/ml)检测结果
 
 
 
CD4及CD8细胞点状二维图结果
 
 
 
不同的荧光物要求选择不同的激发波长,参见下表
 
 
 
(2)细胞的吸入:将装有细胞的FACS测定管放置到机器吸管孔处。
先预检测样品,然后进行实际检测。可根据细胞的浓度选择测定的速度(低、中或高)。所有的数据将自动存入微机。

3.使用后的清洗  所有样品测定完后,要进行仪器的清洗。

(1)将装FACS清洁液的FACS管放置机器吸管孔,高速吸入1分钟。

(2)将装FACS洗净液的FACS管放置机器吸管孔,高速吸入 1分钟。

(3)再将装FACS清洁液的FACS管放置机器吸管孔,高速吸入5分钟。

(4)同样再将装FACS洗净液的FACS管放置机器吸管孔,高速吸入5分钟。

(5)zui后将一装有双蒸水的FACS管放置机器吸管孔后,关闭机器。

(6)将废液槽中的废液倒掉,并清洗干净废液槽。
收起 
注意事项    
1.  减少非特异荧光染色
(1)细胞的活性和状态:流式细胞仪不但可探测细胞表面的荧光,也可探测细胞内的荧光。因此,如果要检测细胞表面的分子,一定要保证细胞的活性,还应尽可能保持细胞静止,通常在4度进行操作。否则,荧光抗体进入死细胞内,会产生非特异结果。

(2)封闭抗体的应用是必不可少的,因为大多数的免疫细胞表面都表达有Fc-R。细胞与抗体相互作用后,一定要用FACS缓冲液洗2~3次,以除去游离的抗体。

2.  单染色时以FACSzui常用,FITC标记抗体荧光比较稳定而且价格合适。

3.  如果同时要检测两种以上的分子,一定要选择不同波长的荧光所标记的抗体。


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