TRIzol法同时提取RNA、DNA、蛋白质

2019年8月02日 23:14:53 来源: 生物在线
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TRIzol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA。TRIzol试剂有多组分分离作用,与其他方法如硫氰酸胍/酚法、酚/SDS法、盐酸胍法、硫氰酸胍法等相比,最大特点是可同时分离一个样品的RNA\DNA\蛋白质.TRIzol使样品匀浆化,细胞裂解,溶解细胞内含物,同时因含有RNase抑制剂可保持RNA的完整性。在加入氯仿离心后,溶液分为水相和有机相,RNA在水相中。取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA;用乙醇沉淀中间层可回收DNA;用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。

TRIzol试剂可用于小量样品(50~100mg组织、5×106细胞)也适用于大量样品(≥1g组织、>107细胞)。对人,动物,植物组织,细菌均适用,可同时处理大量不同样品,整个提取过程在一小时内即可完成。分离的总RNA无蛋白质和DNA污染,可用于Northern Blot,dot blot,ployA筛选,体外翻译,RNase保护分析和分子克隆。在用于RT-PCR时如果两条引物存在于一个单一外显子内,建议用无RNase的DNaseⅠ处理RNA样品,避免出现假阳性。共纯化的DNA可用作标准,比较不同样品RNA的得率,也可用于PCR和酶切。蛋白质可用于Western Blotting。

规格:100ml 黄色透明液体

储存条件:2~8℃避光保存12个月

注意:请勿直接接触皮肤或吞咽,以免灼伤。如接触皮肤应立即用洗涤剂和大量水冲洗。忌用乙醇擦洗,乙醇会加重灼伤程度。

预防RNase污染注意事项:

1.经常更换新手套,皮肤上常带有的细菌,霉菌可能成为RNase的来源。

2.使用灭过菌的RNA专用塑料制品避免交叉污染。

3.RNA在TRIzol试剂中时不会被RNase污染,但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4小时,塑料制品可在0.5M NaOH中浸泡10分钟,然后用水彻底清洗,高压灭菌,即可去除RNase。

4.配制溶液应使用无RNase的水(将水加入处理过不含RNase的玻璃瓶中,加入DEPC至终浓度0.01℅v/v,放置过夜,高压灭菌

注:DEPC有致癌之嫌,需小心操作)。

RNA的提取

准备试剂:氯仿,异丙醇,75℅乙醇,无RNase的水或0.5℅SDS(溶液均需用DEPC处理过的水配制)。

操作步骤:

1. 匀浆处理:

a.组织将组织在液氮中磨碎,每50~100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。

b.单层培养细胞 直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞,每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml,用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定,不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。

c.细胞悬液离心收集细胞,每5~10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1mlTRIzol,反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。

2.将匀浆样品在室温(15~30℃)放置5分钟,使核酸蛋白复合物完全分离。

3.可选步骤:如样品中含有较多蛋白质,脂肪,多糖或胞外物质(肌肉,植物结节部分等)可于2~8℃10000×g离心10分钟,取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜,多糖,高分子量DNA,上清中含有RNA。处理脂肪组织时,上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。

4. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿,剧烈振荡15秒,室温放置3分钟。


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