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核糖核酸酶保护(用核糖核酸酶和放射性标记RNA探针)

2019.9.12

           

实验方法原理 核糖核酸酶保护分析用于度量特异性 mRNA 的丰度以及为它们的拓扑异构特征作图。这种方法包括测试 RNA 与互补的放射标记的 RNA 探针(核糖探针)杂交,然后未杂交的序列被一种或几种单链特异性的核糖核酸酶裂解。
实验材料

RNA 聚合酶 DNase I 蛋白酶 K RNA 酶抑制剂 RNA 酶消化混合液 载体 RNA 核糖核苷酸 标准 RNA 待测 RNA UTP 核糖核酸探针

试剂、试剂盒

乙酸铵 DTT 杂交缓冲液 苯酚 氯仿 RNA 凝胶加样缓冲液 SDS 乙酸钠 TE 转录缓冲液 三氯乙酸 聚合酶稀释缓冲液

仪器、耗材

变性的聚丙烯酰胺凝胶 水浴 Whatman 3 MM 滤纸或类似物

实验步骤

一、材料

1. 缓冲液和溶液

乙酸铵(10 mol/L)

DTT ( 0.2 mol/L)

杂交缓冲液(用于 RNA)(40 mmol/L PIPES (pH 6.8),1 mmol/L EDTA ( pH 8.0),0.4 mol/L NaCl,80% 去离子甲酰胺,使用 PIPES 的二钠盐,用 1 mol/L 的盐酸调节 pH。)

苯酚:氯仿(1:1,V/V)

RNA 凝胶加样缓冲液(95% 去离子甲酰胺,0.025% (m/V)溴酚蓝,0.025% (m/V)二甲苯腈蓝 FF,5 mmol/L EDTA(pH 8.0),0.025% (m/V)SDS)

SDS ( 10% m/V)

乙酸钠(3 mol/L,pH 5.2)

TE ( pH 7.6)

10X 转录缓冲液(0.4 mol/L Tris-Cl( pH 7.5 ),0.1 mol/L NaCl,60 mmol/L MgCI2,20 mmol/L 亚精胺,-20℃ 分装保存)

三氯乙酸(1% 和 10% TCA)

2. 酶和缓冲液

噬菌体编码的依赖 DNA 的 RNA 聚合酶

DNase I ( 1 mg/ml,无 RNase 的胰 DNase)

聚合酶稀释缓冲液

蛋白酶 K ( 10 mg/ml)

RNA 酶抑制剂,置冰上

RNA 酶消化混合液(300 mmol/L NaCl,10 mmol/L Tris-Cl ( pH 7.4),5 mmol/L EDTA(pH 7.5),40 μg/ml RNase A,2 μg/ml RNase T1,用 10 mmol/L Tris-Cl ( pH 7.5 ),15 mmol/L NaCl 制备 10 mg/ml RNase A (小牛胰 RNaae),用 10 mmol/L Tris-Cl ( pH 7.5 ),15 mmol/L NaCl 制备 1 mg/ml RNase T1,凝胶)

变性的聚丙烯酰胺凝胶(含 8 mol/L 尿素)

3. 核酸和寡核苷酸

载体 RNA (1 mg/ml)

用于模板制备的质粒 DNA 或线性靶 DNA

核糖核苷酸

标准 RNA

待测 RNA

UTP (100 μmol/L)

4. 探针

核糖核酸探针

5. 放射活性成分

[α-32P] UTP(10 mCi/ml,800 Ci/mmol)

6. 专用设备

预置到 30℃,85℃,95℃ 和合适复性温度的水浴

Whatman 3 MM 滤纸或类似物

二、方法

制备随机标记的单链 RNA 探针

1. 制备线性 DNA 模板

(1) 从质粒 DNA 制备模板

① 用 5 倍过量的适当的限制性内切核酸酶切割克隆的 DNA 序列内部或下游使 5~20 μg 质粒线性化。线性化后形成的末端与启动子距离应为 200~400 bp。确保所使用的限制酶不直接使启动子与目的序列分离。因为噬菌体编码的 RNA 聚合酶需 3' 末端起始转录,所以选择能产生平末端或 5' 突出端的限制酶。

② 消化反应后,取少量反应液用琼脂糖凝胶电泳分析。确保无痕量的环状质粒可见,否则,加入适量的酶继续消化直到检测不到环状质粒为止。

③ 酚:氯仿抽提两次纯化线形 DNA,再利用乙醇沉淀。沉淀用 70% 乙醇洗涤,pH7.6 的 TE 溶液溶解,浓度为 1 μg/μl。

(2) 靶 DNA 扩增制备模板

① 用 PCR 扩增长度为 100~400 bp 的双链 DNA 模板(Schowalter and Sommer 1989; Bales et al.1993; Davis et al. 1997)。

② 琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳检测 PCR 扩增产物以确保片段大小正确。

③ 酚:氯仿抽提两次纯化线形 DNA,再利用乙醇沉淀。沉淀用 70% 乙醇洗涤, pH 7.6 的 TE 溶液溶解,浓度为 1 μg/μl。

2. 按顺序混合下列溶液,除特殊说明的预热至室温。

0.5 μg 线性的 DNA 模板

1 μl 0.2 mol/L DTT

2 μl 核酸溶液

1 μl 100 μmol/L UTP

50~100 μCi [α-32P] UTP(10 mCi/ml,800 Ci/mmol)

补水至 16 μl

2 μl 10X 转录缓冲液

24 单位 RNA 酶抑制剂(冰上)

15~20 单位噬菌体 RNA 聚合酶(冰上)

室温下按顺序加入上述试剂既可防止 DNA 被转录缓冲液中的亚精胺和 Mg2+ 沉淀,又可防止 RNA 酶抑制剂被高浓度的 DTT 失活。

将上述混合液 37℃ 保温 60 min。

3. 上述反应结束时,加入 1 单位不含 RNA 酶的 DNA 酶约 1 μg,继续 37℃ 保温 10 min。

4. 用 TE 缓冲液(pH 7.6) 稀释反应液至 100 μl,取 1 μl 测量总放射活性和可被 TCA 沉淀的放射活性。通过掺入的可被 TCA 沉淀物质的放射活性比例,计算反应合成的 RNA 探针重量和特异性活性。

5. 第 4 步溶液移取 1 μl 后,在剩余稀释反应液中加入 10 μl 1 mg/ml 载体 RNA。酚: 氯仿抽提反应液,将水相移至一新管,加入 10 μl 10 mol/L 乙酸铵 300 μl 乙醇沉淀 RNA。贮存于 -20℃ 直到第 4 步完成。

6. 4℃ 高速离心 10 min 回收 RNA。75% 乙醇洗涤,再次离心。弃上清,室温干燥 RNA 直到无痕量乙醇可见。若探针需凝胶电泳进一步纯化(步骤7),则用 20 μl 胶加样缓冲液稀释沉淀的 RNA,否则,用 20 μl TE 缓冲液(pH 7.6 ) 稀释沉淀的 RNA。

7. 用预先准备的含有 8 mol/L 尿素的聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化探针。高特异性活性的探针应在近期使用,以避免 RNA 的放射化学损伤。

8. 将待测的每种 RNA 和标准 RNA 核酸探针合并(2X105~10X105 cpm,0.1~0.5 ng) 。加入 0.1 倍体积 3 mol/L 乙酸钠 (pH 5.2)和 2.5 倍体积冰乙醇。将混合物贮存于 -20℃ 10 min,4℃ 高速离心 10 min 回收 RNA。75% 乙醇洗涤沉淀。小心弃去乙醇,室温干燥沉淀直到乙醇完全蒸发。

9. 用 30 μl 杂交缓冲液溶解 RNA。多次上下吹打溶液以保证沉淀彻底溶解。


10. 杂交混合液在 85℃ 保温 10 min 使 RNA 变性,然后迅速将其转移至设置在复性温度的保温器后或水浴中,保温 8~12 h。

11. 将杂交混合液冷却到室温,加入 300 μl RNA 酶消化混和液,30℃ 消化 60 min。

12. 加入 20 μl 10% SDS 和 10 μl 10 mg/ml 蛋白酶 K 终止反应。反应混合液 37℃ 保温 30 min。

13. 加入 400 μl 酚: 氯仿,剧烈震荡 30 s, 室温离心 5 min 分相。

14. 将上相移至新管,小心避免接触两相中间界面。

15. 加入 20 μg 载体 RNA 和 750 μl 冰乙醇。将溶液混合并 -20℃ 放置 30 min。

16. 4℃ 高速离心 15 min 回收 RNA。小心弃去乙醇,用 500 μl 170% 乙醇洗涤沉淀。再次离心。

17. 小心弃去乙醇,室温干燥直到痕量乙醇蒸发。

凝胶电泳分析抗 RNA 酶的杂交体

18. 用 10 μl 凝胶加样缓冲液重悬沉淀。

19. 95℃ 加热核酸 5 min,迅速置冰上。短暂离心使样品收集在管底。

20. 利用含 8 moI/L 尿素的聚丙烯酰胺薄胶电泳分析标记的核酸。

21. 当示踪染料在胶中迁移至合适距离后,关掉电源,拆除电泳装置。轻轻撬开大玻璃板一角,慢慢从胶上移开大玻璃板。切掉胶的一角以辨别方向。

22. 将带有胶的玻璃板移到装有过量的 10% TCA 的托盘中。轻轻在室温下摇动或旋转托盘 10 min。

23. 倒掉 10% TCA 溶液并代之以过量的 1% TCA。轻轻在室温下摇动或旋转托盘 5 min。

24. 倒掉 1% TCA 溶液,用蒸馏的去离子水淋洗固定过的胶。将玻璃板连同胶从托盘中取出放于平板上。用纸从胶边缘吸走多余的水分。

25. 割取一张比胶边缘大 1 cm 的 30 MM 滤纸,将其置于胶上,将玻璃板倒转。

26. 拿开玻璃板,将胶放到凝胶干燥器中 60℃ 干燥 1~1.5 h。

27. 建立胶的自显影影像。通过密度计量学或磷光摄影扫描,也可以切下胶中含有相应片段的部分,利用液闪仪计数。

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