| 实验步骤 |
材料
牛血清白蛋白（BSA，1%)
猪胰岛素〔17.5/umol/L(0.1 mg/ml) 于 0.001mol/LHC1 中〕（如 Sigma Chemical Co.13505)
[125I] 胰岛素 (受体级)(DuPontNEN NEX 196)(2200uCi/mmol，35.5nmol/L)
试剂
结合缓冲液（供两点结合试验法用)
(配方，见 试剂的配制 PP.234~240)
操作程序
1) 于两只微量离心管中各加 40ul 大鼠肝的质膜（20 mg/ml), 记作#1 和#2。
2) 各管加 30ul 1%BSA。
3) 各管加 140ul 结合缓冲液 。
4)#2 管中加 60ul 17.5umol/L 猪胰岛素 (使终浓度为 3.5umol/L）,#1 管中加 60ul 蒸馏水。
5) 各管加 30ul 5nmol/L[125I] 胰岛素（使 [125I] 胰岛素的终浓度为 0.5nmol/L)。
6) 离心管置旋转摇床上室温孵育 2 h，或 4℃孵育 16 h。
7) 离心管置微型离心机中离心 20 min。尽可能多地取出上清。
注：如配体对受体亲和性高（如 KD=10-11), 可洗涤沉淀以去除游离的配体。不过，若配体对其受体只有低的或中度的亲和性，则洗涤可能会部分解离配体-受体复合物。
8) 用 y-计数器测量管中的放射性强度。从#1 管的 cpm 值（总 cpm 值) 减去#2 管的 cpm 值（非特异结合计数和本底计数)，即得特异结合 cpm 值。
胰岛素结合量的计算
激素-受体相互作用的标准公式通常表示为:
式中，[H] 是游离配体的浓度，[R] 是游离受体的浓度，[HR] 是激素-受体复合物的浓度。达成平衡时，解离常数为
因此，[H] = [H]t - [HR](式中 [H]t 为配体的总浓度)，[R]t = [R] + [HR] (式中 [R]t 为受体的总浓度)。重排等式，则可得 KD 为：
对于两点结合试验，可假设鼠肝胰岛素受体的 KD 为10-9mol/L。于是，可根据测出的 [HR] 和 [H] 计算出受体的总浓度 [R]t。
为确定比活性，可由 胰岛素结合量 除以样品中的蛋白量，或由 [R]t 除以试管中的蛋白浓度得出。此计算结果通常以 pml(结合胰岛素)/mg(蛋白）来表示。 |
