武汉病毒所Nature发文：揭示肺炎疫情很可能由蝙蝠导致
在过去的二十年中，冠状病毒已引起两次大规模疫情：严重急性呼吸综合征（SARS）和中东呼吸综合征（MERS）。一般认为，主要在蝙蝠中发现的SARS 相关冠状病毒（SARSr-CoV）可能会导致未来疫情暴发。
在一项新的研究中，中国科学院武汉病毒研究所、武汉金银潭医院和湖北省疾病预防控制中心的研究人员报道了位于中国中部的湖北省武汉市发生了一系列病因不明的肺炎疫情。从当地的一家海鲜市场开始，到2020年1月26日为止，疫情已蔓延至中国有2050人感染，其中56人死亡，其他11个国家有35人感染。相关研究结果于2020年2月3日在线发表在Nature期刊上，论文标题为“A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin”。重要的是，Nature期刊在2020年1月20年收到这篇论文的手稿，1月29日就接受了这篇论文，并以“加快评审文章（Accelerated Article Preview）”的形式了在线发表了这篇论文。论文通讯作者为中国科学院武汉病毒研究所石正丽（Zheng-Li Shi）研究员。
这些患者的典型临床症状是发烧、干咳、呼吸困难、头痛和肺炎。疾病发作后可因肺泡损伤导致进行性呼吸衰竭（如横向胸部CT图像所观察到的那样），甚至死亡。根据临床症状和其他标准，包括临床体温升高，淋巴细胞和白细胞减少（有时白细胞正常），胸部X光片上出现新的肺部浸润，三天抗生素治疗无明显好转，临床医师将这种疾病确定为病毒性肺炎。大多数早期病例似乎都与最初的那家海鲜市场有接触史，但是如今这种疾病已发展为人与人之间的传播。
在疫情开始时就进入了重症监护病房（ICU）的7名重症肺炎患者（其中有6名是海鲜市场销售者或送货者）的样本被送至中国科学院武汉病毒研究所（WIV）实验室进行病原体诊断。考虑这次疫情发生的环境与SARS相同，即在冬季和在一家海鲜市场里，石正丽及其课题组在冠状病毒（CoV）实验室中首先使用泛冠状病毒PCR引物来测试这些样本。他们发现了5个PCR阳性样本。通过使用下一代测序（NGS）对从支气管肺泡灌洗液（BALF）中收集的样本（WIV04）进行宏基因组分析以鉴定潜在的病原体。
在总共10038758个读取片段（read），或者说人类基因组过滤后的总共1582个读取片段中，有1378个读取片段与SARSr-CoV序列相匹配（图1a）。通过从头组装和靶向PCR，他们获得了一个大小29891 bp的冠状病毒基因组，它与SARS-CoV BJ01（GenBank登录号AY278488.2）具有79.5％的序列一致性（sequence identity）。将这些1582个读取片段与所获得的基因组进行重新映射可取得较高的基因组覆盖。这个基因组序列已被提交GISAID网站（登录号EPI_ISL_402124）。根据世界卫生组织（WHO）的名称，他们暂时将它称为新型冠状病毒2019（2019-nCoV）。随后从其他四名患者中使用NGS和PCR获得了另外四个2019-nCoV全长基因组序列（WIV02，WIV05，WIV06和WIV07）（GISAID登录号EPI_ISL_402127-402130），彼此之间的一致性高于99.9％。
2019-nCoV基因组由冠状病毒共有的6个主要的开放阅读框（ORF）和一些其他的附属基因组成（图1b）。进一步的分析表明，一些2019-nCoV基因与SARS-CoV在核苷酸序列上的一致性低于80％。然而，用于冠状病毒物种分类的开放阅读框ORF1ab中的七个保守性复制酶结构域在2019-nCoV和SARS-CoV之间具有94.6％的氨基酸序列一致性，这意味着这两者属于同一病毒物种。
他们随后从蝙蝠冠状病毒BatCoV RaTG13中发现了一个短的RdRp区域，这个区域之前在云南省的中菊头蝠（Rhinolophus affinis）中检测到，它与2019-nCoV具有高度的序列一致性。他们对这种RNA病毒样本（GISAID登录号EPI_ISL_402131）进行全长测序。Simplot分析显示，2019-nCoV在整个基因组中与RaTG13非常相似（图1c），全基因组序列一致性为96.2％。
通过使用2019-nCoV、RaTG13、SARS-CoV和先前报道的蝙蝠SARSr-CoV的比对基因组序列，在2019-nCoV基因组中未检测到重组事件发生的证据。对全长基因组、RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp）基因和S基因序列的系统进化树分析均显示RaTG13与2019-nCoV存在最密切的亲缘关系，与其他SARSr-CoV形成不同的谱系（图1d）。2019-nCoV的编码受体结合蛋白---刺突蛋白（S）---的基因除了与RaTG13的S基因具有93.1%的核酸序列一致性外，与其他冠状病毒高度不同，与所有先前描述的SARSr-CoV的核苷酸序列同一性低于75％。2019-nCoV的S基因和RaTG13的S基因比其他SARSr-CoV要长。与SARS-CoV相比，2019-nCoV的S蛋白的主要区别是N末端结构域中的三个短插入序列和受体结合基序中的5个关键氨基酸残基有4个发生了变化。2019-nCoV的S蛋白在N末端结构域的插入序列是否具有像MERS-CoV那样的唾液酸结合活性需要进一步研究。2019-nCo与RaTG13存在密切的系统进化关系为2019-nCoV起源于蝙蝠提供了证据。
他们基于S基因的受体结合结构域（不同冠状病毒基因组中变化最大的区域）快速开发了一种qPCR检测方法（图1c）。他们的数据显示，针对这种检测方法设计的引物可以将2019-nCoV与所有其他人类冠状病毒（包括与SARS-CoV存在95％一致性的蝙蝠SARSr-CoV WIV1）区分开。在这7例患者中，他们在针对qPCR和常规PCR测试的首次采样期间，在6个BALF样本和5个口腔拭子样本中检测到2019-nCoV阳性。但是，在第二次采样期间，他们在来自这些患者的口腔拭子、肛门拭子和血液中不再检测到2019-nCoV阳性（图2a）。他们必须指出，包括RdRp或E基因在内的其他qPCR靶标可能用于常规检测。基于这些发现，他们认为这种疾病应当通过呼吸道传播，但是如果将研究扩大到更多的患者，他们不能排除其他的传播可能性。
为了对2019-nCoV进行血清学检测，他们使用了先前开发的蝙蝠SARSr-CoV Rp3核衣壳蛋白（NP）作为IgG和IgM ELISA测试中的抗原，这种核衣壳蛋白与2019-nCoV的核衣壳蛋白具有92％的氨基酸一致性，结果表明与除了SARSr-CoV之外的其他人类冠状病毒不存在交叉反应。作为研究实验室，他们只能从这7名病毒感染患者中获得了5个血清样本。他们在疾病发作后的第7、8、9和18天监测了其中的一名患者（ICU-06）的病毒抗体水平，结果观察到明显的IgG和IgM抗体滴度增加趋势（在最后一天下降）（图2b）。在第二项实验中，他们在疾病发作后约20天左右对这7例病毒阳性患者中的5例进行了病毒抗体检测。所有患者样本而不是健康人样本，均显示较强的病毒IgG阳性（图2b）。他们还发现了三个IgM阳性样本，这表明是急性感染。
他们随后使用了来自ICU-06患者的BALF样本在Vero细胞和Huh7细胞中成功分离出了这种病毒（名为2019-nCoV BetaCoV/Wuhan/WIV04/2019，下称毒株WIV04）。在培养三天后，在细胞中观察到明显的致细胞病变作用。通过使用交叉反应性病毒核衣壳蛋白抗体进行免疫荧光显微镜检查、通过宏基因组测序表明它的大多数读取序列可映射到2019-nCoV以及qPCR测试表明病毒载量从第1天到第3天发生增加，毒株WIV04的身份在Vero E6细胞中得到了验证。
在电子显微镜下，受感染细胞的超薄切片中的病毒颗粒显示出典型的冠状病毒形态。为了进一步确认病毒IgG阳性样本的中和活性，他们使用5个IgG阳性患者血清在Vero E6细胞中进行了血清中和测定。他们证实所有血清样本均能够以1：40～1：80的稀释度中和120 TCID50 2019-nCoV。他们还发现，这种病毒可以在1:80的稀释度下被马抗SARS-CoV血清交叉中和，但与SARS-CoV抗体交叉反应的潜力需要通过人抗SARS-CoV血清加以验证。
血管紧张素转化酶II（ACE2）被认为SARS-CoV的细胞受体。为了确定2019-nCoV是否也将ACE2作为细胞进入受体，他们使用表达或不表达人类、中华菊头蝠、果子狸、猪和小鼠的ACE2蛋白的HeLa细胞进行了病毒感染性研究。他们发现2019-nCoV能够使用除小鼠ACE2以外的所有其他物种的ACE2蛋白作为表达ACE2的细胞中的进入受体，但在不表达ACE2的细胞中不会如此，这表明它很可能是2019-nCoV的细胞受体（图3）。他们还证实2019-nCoV不使用其他的冠状病毒受体：氨基肽酶和二肽基肽酶4。
这项研究提供了关于2019-nCoV的第一份详细报道，其中2019-nCoV是造成中国中部武汉市正在发生的急性呼吸道综合征疫情的可能病因。在所有测试的患者中观察到的病毒特异性核苷酸阳性和病毒蛋白血清转化提供了这种疾病与这种病毒的存在之间存在关联性的证据。但是，仍然有许多紧急问题需要解决。尚未通过动物实验来证实2019-nCoV与这种疾病之间的关联性以充分符合科赫法则（Koch's Postulates）。他们还不知道这种病毒在宿主之间的传播途径。这种病毒似乎在人与人之间传播的可能性越来越大了。我们应当密切监视这种病毒是否继续演变成更强的毒性。由于缺乏特异性治疗，并考虑到SARS-CoV与2019-nCoV之间的相关性，一些针对SARS-CoV的药物和临床前疫苗可能可以用于抵抗这种病毒。最后，考虑到SARSr-CoV在它们的天然病毒库中的广泛传播，未来的研究应当集中在更广泛的地理区域对它们进行主动监视。从长远来看，应当为这类病毒引起的未来新兴传染病准备广谱抗病毒药物和疫苗。最重要的是，应对野生动物的驯养和消费制定严格的法规。
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