( 7 ) 关上泵，加入水饱和的丁醇以确保覆盖住胶的顶部和下部（丁醇在分隔液的上部），放置 1 h，然后倒掉丁醇，覆盖 Milli-Q H2O。

( 8 ) 胶最好是在室温放置过夜，当彻底凝固时再用。拆除灌胶仪器，洗掉玻璃板上的丙烯酰胺。立刻用胶或者放冰箱暂存（最多可以保存一个星期）。

3.6 二向蛋白质分离：SDS-PAGE

( 1 ) 从托盘中取出等电聚焦胶条，用 Kimwipe 轻轻擦拭胶条的前后端以除去过多的矿物油，小心不要将 Kimwipe 触到胶条，如果需要干胶条可以保存在 -80°C 冰箱中。

( 2 ) 将胶条放在平衡托盘中，一端稍高放置。

a. 在摇床上，用 2 ml 新鲜的还原再平衡缓冲液洗胶条 30 min。

b. 弃还原再平衡缓冲液，加 2 ml 新鲜的烷基化再平衡缓冲液。

c. 摇床摇 30 min，弃烷基化平衡缓冲液。

d. 加 2 mL SDS 电泳缓冲液，摇床摇 5 min。

( 3 ) 仔细将胶条放入预先制备好的 24 cm 的凝胶上（见 15.3.5 节） ，将胶条的塑料一端靠在玻璃板的一端，这样使胶条容易、方便放置在凝胶上，胶条和凝胶之间不能有气泡，用 0.5% ( m/V ) 的琼脂糖密封液密封胶条，吸取密封液，放置在胶条上部，室温凝固。

( 4 ) 将凝胶的胶板放入与循环的冷水系统相连的 Ettan  DALTsix 电泳室里。

a. 将胶放在小槽的外部，当同时跑几块胶时，将它们均匀地放在两边，面向同一个方向。

b. 将空胶板放在池子里，直到每个槽都放满。

c. 灌入电泳缓冲液，直到到达最大刻度线的底部。

d. 将盖子与底部电源接通，开始电泳。

e. 如果是过夜电泳，设置电量为 2 W/gel。如果只在白天电泳，可以提高电压，但不要超过 8 W/gel。

3.7 荧光图像扫描

( 1 ) 打开 Typhoon 扫描仪，在使用前先预热 30 min，预热是为了扫描更精确。

( 2 ) 在使用前后都必须用乙醇和擦拭纸将玻璃板擦干净。不要用纸巾擦拭，因为容易刮伤玻璃面。

( 3 ) 将玻璃板从胶槽中取出，表面擦干净，将玻璃 cassettes 中的荧光标记凝胶按正确的方向放在玻璃板上。

( 4 ) 用合适的滤波和波长来扫描图像，每种标记物的波长如下：Cy3 用 580BP 的滤波，532 nm 的绿色激发光；Cy5 用 670BP 的滤波，633 nm 的红色激发光；Cy2 用 520BP 的滤波，488 nm 的蓝色激发光。初始参数为 depth+ 3 mm，600 V 光电倍增管设置和 500 μm 的像素，反复进行 50~100 μm 的像素高分辨率扫描。

( 5 ) 用 Typhoon 扫描仪软件可以获得图像，用数据集格式保存在包含 gel 图像的相关文件夹中，这样可以用 ImageQuant 打开，然后可以用数据集格式再保存，用来在 DeCyder 作进一步的处理。或者 Tiff 格式，可以使用其他图像分析包来做进一步的处理，如 Progenesis  ( Nonlinear  Dynamics) 。

3.8 图像分析

通过不同波长所获得的图片用 DeCyder 进行比较分析（见注释 8) ，由于程序复杂 ，在此不作详细介绍，基本步骤如下所述。

( 1 ) 为了确保图像大小完全匹配，用 Process Image 测量而且进行标准化，产生一个柱状图，显示两张图片中没有产生变化的、增加的、减少的蛋白质点数量。

( 2 ) 使用排除过滤法，或手动删除任何明显的非蛋白质背景斑点或条纹。按照需要，调整柱状图的临界参数显示蛋白质点。这些蛋白质点是指定量的上调或下调表达，如大于 2 倍的差异。

( 3 ) 手动检查柱状图和图像，以确定哪些点有明显表达变化，而且有足够的量用于质谱鉴定。在大多数情况下，许多蛋白质尽管有显著差异表达，但由于量很少以致于无法进行可靠的定量和可行的鉴定。最值得研究的蛋白质点通常具有中、高丰度而且差异表达非常明显。

( 4 ) 为了更精确地定量差异表达，特别是差异性非常微弱的情况下，整个程序需要重复 3 次，这样结果才有统计学意义（见注释 8) 。

3.9 为了进一步处理进行再染

接下来是进行图像分析。取走玻璃盒里的隔条，胶进行银染 [ 29，30]。银染要在固定的玻璃板上进行，这样可方便观察，并且可以手工挖取蛋白质点，以进行下一 步的质谱鉴定 [6]。相对于 CyDye 标记只能标记少部分蛋白质而言 [8] ，银染能保证绝大多数的蛋白质都能标记上。通过银染，用 CyDye 标记的大部分蛋白都能看见，尽管在不同的样品之间还是有一些变化。比对银染的图像和 CyDye 图像，小心确保挖到正确的点。一些小分子质量的 CyDye 通常会引起一些漂移，一些蛋白用不同方法也会引起一些差异（见注释 9)。

3.10 结果分析：番茄根部响应盐胁迫的蛋白质表达差异测定

1. 盐胁迫处理

( 1 ) 在控温温室里，让番茄长到 4 英寸（1 英寸= 25. 4 mm) 高。

( 2 ) 在试种时，将 20 棵幼苗在包含 MiracleGro 肥料的 Hoglan 混合肥料中生长。

( 3 ) 所有 20 棵植株每天正常浇水。20 天后，对其中的 10 株进行标记，用 25 mmol/L NaCl 处理一个星期。在此后的一个月时间里，逐渐将 NaCl 浓度提高到 100 mmol/L。

( 4 ) 10 株对照植物在整个期间都用水浇灌。

2. 叶和根组织的收集

( 1 ) 在 7 个星期期间，在连续浇灌了两个星期的 100 mmol/L 氯化钠之后，剪下 3~5 g 对照及处理的健康植株叶片，一个星期两次，直到叶片坏死。

( 2 ) —旦叶片坏死，植株连根拔起，用水冲洗根部，从根的中部分成近茎端和远茎端两部分，立刻液氮中进行速冻。

3. 近茎端蛋白质的抽提

( 1 ) 用研锤将收集到近茎端根研碎。

( 2 ) 按 15.3.1 节提到的 TCA 丙酮方法制备蛋白质沉淀物。

( 3 ) 由于凝胶上显示根所含的蛋白质比叶少，有必要按 15. 3. 2 节的方法抽提 3 次蛋白质，将这 3 次抽提的蛋白质放入到一个离心管中，进行 CyDye 标记 。

( 4 ) 汇集样品，跑胶用 15. 3. 3 节、15. 3. 6 节的方法分析，结果见图 15 -1 ~ 图 15-4。

4. 对照及盐胁迫的近根组织部分 DIGE 凝胶的图像比较分析

来源于 4.3 的数据用 DIA 模型进行分析，这种模型在 15.3.8 节中已有介绍。从 DeCyder 程序输出的起始数据用虚拟颜色代表，如图 15-1 所示。Cy 5 标记的对照植株蛋白点为红色，Cy3 标记的盐胁迫植株的蛋白质点为绿色，两种植株都有且表达量相似的蛋白点为黄色。这样对于那些表达差异明显的蛋白质易于识别。在这个实验示例中，绝大多数的蛋白质点为黄色，说明这两个样品中蛋白表达差异不是很明显。

两种荧光波长扫描的不同图像如图 15-2 所示，这些图像可以用来进一步分析蛋白质表达差异。这两张图像看起来很相似，但是图 15-2B 上的蛋白点更多。总体蛋白质载入或者是标记效率有明显的区别，这也是这种方法的一个显著优点。软件可用于标准化这两张图像的表达量，所有的蛋白点包含在内，只有那些表达量高于或低于平均值的蛋白质点被标示为差异蛋白点。

两个图像的定量分析产生的柱状图如图 15-3 所示。正如蛋白质点检测窗口所示，在标准化和处理后，软件检测到 421 个蛋白质点，其中有 384 个没有变化的蛋白点， 34 个 Cy3 标记的表达量升高的蛋白点，3 个 Cy5 标记的表达量升髙的蛋白点。x 轴为这两个图片的蛋白质点的体积的 log 值的比率，左边的 y 轴为蛋白质点的频率，右边的 y 轴为代表每个蛋白点的绝对突光强度，也就是蛋白质量。蓝色曲线表示蛋白质点频率模式柱状图，是基于红色曲线的实际柱状图生成的。

两条垂直的线表示蛋白质表达差异达 1.5 倍的 x 轴点和表达没有变化的蛋白质点，颜色使用策略和图 15-1 相似，黄色代表没有变化的蛋白点，绿色代表 Cy3 标记表达量升高的蛋白点，红色代表 Cy5 标记表达量升高的蛋白点。

在这种类型的分析中，许多蛋白点检测到表达量上有变化，但是这种变化是很微弱的以至于不易鉴定。在图 15-3 的分析中，我们运用了一个绝对荧光阈值即 106 荧光单元（如虚线所示）来排除这些蛋白质点。这里有 4 个蛋白质点，标记为 a~d，x 轴上在正常分布曲线之外，y 轴上超出了 106 荧光单元，因此这些蛋白点为 Cy3 标记的表达量超过 1.5 倍的蛋白点，这种表达量可以用来进行质谱鉴定。在柱状图里还有很多蛋白质表达差异显著，但是低于我们指定的阈值。

这 4 个强调的蛋白质代表那些响应盐胁迫并且上调表达量超过 1.5 倍的蛋白质。前 3 个蛋白点即标记为 a 、b 和 c 的蛋白点突显了这种方法的缺点，它们是一个低分辨率蛋白质的一部分，这个蛋白质已经用分析软件人工划分为几个蛋白点。然而标记为 d 的蛋白点是一个髙分辨率的蛋白点，荧光体积率为 1.79， 如图 15-4 所示，这个蛋白点可以切下来进行质谱鉴定。