荧光显微镜的原理及应用如何？

　　荧光的原理是某些物质会在高强度的短波长光线照射下，会发出波长稍长的发射光（荧光）。而我们一般都是观察被激发荧光基团所发射出来的波长稍长的发射光（荧光）。

　　但是激发的光会很强，所以我们就需要把激发的光全部滤去，这样才可以看到荧光基团的发射光（荧光）。

　　荧光显微镜一般都用高强度的汞灯做激发光源。使用滤色片把不需要的光滤去，只留下激发荧光集团的高强度很纯的光线。这个单色的光线通过物镜照射到样本上之后，样本会被激发出发射光（荧光），荧光和激发光都会沿着物镜光路返回，这样的话，就需要用一个二相色镜把激发光滤去，只让我们需要看到的荧光透过。

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　　这个荧光沿着显微镜的光路到达目镜下，然后进入我们的眼睛，我们就可以看到荧光基团所发出来的荧光了。

　　荧光显微镜的预检查和调节：

　　(1)每次进行荧光观测前，必须例行检查荧光装置的灯丝对中、光路对焦、孔径光阑、视场光阑设置等状况。

　　(2)所需要的荧光激发/发射滤光片组件是否已装在转换器中，荧光显微镜物镜配置是否得当，除去物镜前透镜的油渍和灰尘。

　　(3)如同时进行透射光相差观察，要检查聚光镜对中心及相差环与物镜相反的共轭情况。

　　(4)检查样品载体(载玻片、盖玻片和其他器皿)有否挂有液体、灰尘，厚度是否在物镜标定的工作距离范围内。切片样品不能太厚，约≤10μm为宜。

　　(5)因照明光源含有紫外线，在载物台前上方放一块棕色遮光板，以防紫外线损伤视网膜。

　　(6)电压不稳会降低高压汞灯的使用寿命，光源电源加配稳压器。

　　(7)为延长汞灯寿命，在开启后15min方可关闭；汞灯荧光电源一旦关闭，再次启动至少需等待10min，以使水银蒸汽冷却复至原态，否则会影响灯的寿命。

　　荧光显微镜的像观察：

　　(1)在开启荧光灯源后约5～10min激发光强度趋于稳定，装载样品进行观察；为防止在调焦和寻找物像过程中过度激发光照会造成样品荧光淬灭，先通过缩小荧光显微镜的孔径光阑或加ND滤光片将激发光调节到适度强度，有规律地移动样品台，待确定镜像后，在调节到荧光状态用于拍摄记录。

　　(2)镜像质量不佳的调整。排除样品制备因素外，可进行的必要调节措施是：

　　①排除成像光路中的遮光或限光器件，如DIC附件、ND滤光片等。

　　②重新调节荧光显微镜的收光器对焦和孔径光阑大小。

　　③细心调节荧光显微镜物镜覆盖差校正环。

　　荧光显微镜的应用要点

　　荧光显微镜是利用“光化荧光”成像，如果所选激发波长在肉眼所看不见的近紫外光区(320～400nm)，荧光的发射光谱也较普通光镜光源的平均波长短，光学分辨率提高。高能量的光子与电子碰撞，使得电子从基态跃迁到激发态。激发态的电子很不稳定，会重新回落到基态，这个过程中会消耗部分热能，并发出新的光子。新的光子能量比起初的光子能量低，因此波长更长。由于新的光子波长区别于入射光的光子波长，通过一定的光学处理方法将两束不同波长的光分开，从而使我们只看到发射出来的新光子（荧光信号），也就是荧光显微镜看到的荧光图像。

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