MAPK激酶活性检测
实验概要
本实验提供了一个MAPK激酶活性的检测方法。
主要试剂
1uM f1g22,10uM flg22
0.02% Silwet L-77
液氮
蛋白提取缓冲液(100 mM Hepes, pH 7.5,5 mM EDTA, 5 mM EGTA, 10mM DTT, 10 mM Na3VO4, 10 mM NaF, 50 mM P-glycerophosphate, 1 mMphenylmethylsulfonyl fluoride, 5 pg/mL antipain, 5 pg/mL aprotinin, 5 pg/mL leupeptin,10% glycerol, 7.5% polyvinylpolypyrrolidone)
0.25 mg/mL myelin basic protein(MBP)
漂洗缓冲液(25mM Tris, pH 7.5, 0.5mM DTT,0.1mM Na3V04, 5mM NaF, 0.5 mg/mL BSA, 0.1%Triton X-100)
复性缓冲液(25mM Tris, pH 7.5, 1mM DTT, 0.1mM Na3VO4, 5 mM NaF)
200nM的ATP,50uCi r-P32-ATP
主要设备
高速离心机,研钵,蛋白电泳槽,电泳仪,Phosphorlmager
实验材料
植物叶片
实验步骤
1. 挑选约5-6周大且生长状态良好的植物叶片,按照原生质体分离方法(http: //www. genetics. mgh. harvard. edu_ sheenweb)分离原生质体。分别转化各实验中对应的质粒后室温孵育6小时,再加入1uM f1g22或者水处理10分钟后提取蛋白,进行in-gel kinase assay。在植物中,将10uM flg22或者水,再加上0.02% Silwet L-77后均匀的喷洒在植物叶片上,10分钟后取下叶片提蛋白,进行in-gel kinase assay。
2. 蛋白提取
1) 取6-8片叶片,液氮速冻后研磨成粉末。
2) 加入蛋白提取缓冲液继续研磨直至均匀。
3) 14000rpm于4℃离心10分钟,取上清。
3. 激酶活性分析
1) 在分离胶中掺入0.25 mg/mL myelin basic protein(MBP)作为激酶底物,配制成10%的SDS-PAGE胶,取10ug蛋白电泳。
2) 电泳结束后取下蛋白胶,用漂洗缓冲液于室温洗三次,每次30分钟。
3)将蛋白胶置于复性缓冲液中于4℃过夜,中间换3次缓冲液。
4) 将复性后的蛋白胶置于反应缓冲液中,再加入终浓度为200nM的ATP以及50uCi r-P32-ATP,反应60分钟。
5) 用终止缓冲液漂洗蛋白胶6次,每次60分钟。
6) 取出蛋白胶干胶后储存于Phosphorlmager。
7) 24小时后放射自显影。