细胞培养生化分析仪选择指南（一）
单抗类药物的出现为人类一些自身免疫病、癌症等疑难病的诊断与治疗开辟了广阔前景，在为人类健康作出突出贡献的同时也为企业带来非常可观的收入，已成为近年来销售额最高的一类生物技术药物。虽然哺乳动物细胞培养技术要求高、抗体表达能力低、生产成本高，但具有其它表达系统无法取代的优势 ：能够准确的完成糖基化、折叠、链内及链间二硫键的形成等一系列翻译后修饰，因此其表达的抗体在分子结构、理化特性和生物学功能方面更接近天然产物。自 1996 年以来，FDA批准的生物技术产品中，有 2/3 以上是通过哺乳动
物细胞系统生产的。而中国仓鼠卵巢细胞（CHO）约占哺乳动物细胞表达的90%以上，中国仓鼠卵巢细胞（Chinese hamster ovary，CHO）由于具有抗剪切力，易于放大培养的优势，是目前使用最广泛的哺乳动物细胞表达系统。目前使用最广泛的 CHO 表达系统是二氢叶酸还原酶（DHFR）和谷氨酰胺合成酶（Glutamineynthetase，GS）表达系统。
近年来关于CHO细胞大规模培养的研究越来越多，在很多情况下生物反应器中哺乳动物细胞生产的蛋白质类产品的产量都已达克级有的甚至可达10克级，比80年代中期提高了100多倍，用于治疗各种疾病的生物产品的种类也越来越多，这些成果的取得大都依赖于工程宿主细胞的改良，培养基的优化以及许多其他工艺流程的创新。基因组的勘探和细胞工程技术的普遍应用大大方便了科学家对宿主细胞的改造，赋予细胞生长和蛋白产品所期望的特点。
一、生化分析仪在细胞培养中的应用
监测代谢废物的积累
目前公认，在分批培养和大多数流加培养中，乳酸、氨以及其它代谢产物随着时间的延长在培养基中积累，这些产物抑制了细胞的生长。乳酸一直被认为是在生物反应器中实现高密度细胞浓度的一个障碍，人们一直在为减少乳酸的产生做了各种不懈的努力。科学家推测乳酸的积累（即葡萄糖通过糖酵解生成乳酸，而不是进入线粒体完全氧化）一个原因可能是丙酮酸进入线粒体受到了限制，或者TCA循环和氧化磷酸化发生了障碍。这一猜测意味着，如果有足够的碳流量（主要是丙酮酸）进入线粒体产能以及足够的化学能流出（ATP）到细胞质中，然后以某种方式通过负反馈调节机制，葡萄糖的过度消耗就会减少，乳酸的产生也随之降低。一些其他的因素比如高渗透压以及活性氧的积累都有可能对细胞生长带来损伤，最终导致细胞活率以及蛋白产量的降低。乳酸和氨的积累对细胞培养的影响比较复杂，对细胞的生长、蛋白产量以及细胞代谢的带来的变化都有报道。尽管乳酸和氨可能不是培养基中产生的唯一的抑制物，但是它们的积累确实影响了细胞的生长速度，同时乳酸和氨也是灌流培养反应器中需要去除的主要代谢产物。
CHO转化细胞无论是在氧气充足还是氧气缺乏的时候都倾向通过糖酵解代谢大量的葡萄糖， 这将导致大量的乳酸的产生，这种现象被称为Warburg 反应。
最近有研究报道对细胞的这种现象做出了解释，他们认为这是细胞快速的将环境
中的营养物质转化为细胞生物量的一个适应过程。然而不同的细胞所耐受的乳
酸浓度也不一样， 例如当培养基中乳酸浓度高于55mM时，杂交瘤细胞的生长速率降低50%,当乳酸浓度高于60mM时，CHO细胞的生长速率降低25%。
确定流加工艺关键控制点
目前上市的重组抗体中绝大多数是采用流加（Fed batch）培养工艺生产，这主要由于与之配套的生物反应器（搅拌罐、气升罐等）制造成熟，可线形放大（最大至20,000L），操作简单等原因。但是，流加培养过程中会出现营养物质消耗、代谢废物积累，以及产品质量不稳定等问题。因此需要对流加过程进行监控以减少代谢副产物的积累， 使细胞培养时间得以延长，细胞密度以及蛋白类药物的产量也都能得到增加。
而流加培养中减少代谢物的主要途径就是通过控制补料方式减少可利用的葡萄糖以及谷氨酰胺使葡萄糖的浓度维持在较低的水平。实验结果表明，当外部的葡萄糖和氨基酸浓度控制在较低水平时，细胞代谢倾向于向更有效的途径转变，过度代谢的流量和代谢物的排泄将大大减弱， 表现为培养基中乳酸的生成大大减少， 细胞代谢从一个高产乳酸的状态转变为低产乳酸的状态。
优化培养基配方
动物细胞的体外培养，涉及生物反应器的物理参数（温度、pH、DO、DCO2等）、培养基的营养成分（葡萄糖、谷氨酰胺、氨基酸、维生素等）的消耗，以及自身代谢产物（乳酸、氨、重组蛋白等）的积累与生理生化参数（细胞密度、活性，能荷等）的变化。作为重组抗体生产的“细胞工厂”，上述过程参数的改变会直接影响生产细胞系的活性与重组抗体的收率。比如：当乳酸（58
mM）、渗透压（382 mOsm/kg）、氨（5.1
mM）参数超过其相应的阈值，细胞活性和抗体产量均会明显下降[6]。目前，业内已经对于细胞培养过程参数进行了深入的研究，在动物细胞大规模培养中下述参数的控制也已成定式（见下表）。
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参数 |
控制（或测定）范围 |
检测手段 |
控制策略 |
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营养物质 |
葡萄糖 |
0~10g/L |
生化分析仪、酶试剂盒 |
葡萄糖限制性流加 |
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谷氨酰胺 |
0~10mM |
谷氨酰胺限制性流加 |
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氨基酸 |
0~10mM |
HPLC |
流加浓缩培养基 |
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核苷酸 |
0~10mM |
HPLC |
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代谢产物 |
乳酸 |
0~50mM |
生化分析仪、 酶试剂盒 |
使用半乳糖替代葡萄糖 |
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氨 |
1~10mM |
使用丙酮酸、谷氨酸替代谷氨酰胺 |
流加培养工艺的优化主要集中在基础培养基、流加培养基以及流加策略上，其优化的原则是根据细胞的代谢特点设计补料培养基，用于补充易耗成分，降低副产物积累。
生化分析仪选购原则
1.生化分析仪的分类
生化分析仪又常被称为生化仪，是采用光电比色原理来测量体液中某种特定化学成分的仪器。由于其测量速度快、准确性高、消耗试剂量小，现已在各级医院、防疫站、计划生育服务站得到广泛使用。配合使用可大大提高常规生化检验的效率及收益。
常见的生化分析仪基于两种基本原理：第一是酶比色法也就是传统意义上的生化分析仪，第二是类是随着生物科技的发展酶分子改造技术、酶的固定化技术的发展酶电极法生化分析仪应用而生，主要应用于战地医疗、ICU等对检测速度、检测环境又特殊要求的场合。
1.1光学比色生化分析仪发展历程
第一代：分光光度计
第二代：半自动生化分析仪：半自动生化分析仪指在分析过程中的部分操作（如加样、保温、吸入比色、结果记录等某一步骤）需手工完成，而另一部分操作则可由仪器自动完成。
第三代：全自动生化分析仪：1957年诞生于美国，全自动生化分析仪，从加样至出结果的全过程完全由仪器自动完成。操作者只需把样品放在分析仪的特定位置上，选用程序开动仪器即可等取检验报告。按照仪器结构原理可分为 ：连续流动式（管道式）、分立式、离心式和干片式四类。
1.1.2光学比色生化分析仪检测过程
（1）检测原理（针对细胞培养项目）：底物经过一系类的酶的作用生成过氧化氢，过氧化氢与4-氨基安替比林反应生成红色醌类物质在540nm处有吸收峰。
（2）检测过程：加样——加试剂——混合——保温反应——检测——输出结果。
