LC-MS/MS与柱前衍生法用于脑脊液和脑微透析液中...（一）
LC-MS/MS与柱前衍生法用于脑脊液和脑微透析液中神经递质类物质的代谢靶标分析
1. 前言
在广义的代谢组学（Metabolomics）研究中，代谢靶标分析是一种常见的研究策略，它以处于特定代谢通路上具有相似/相近生物功能的一系列小分子物质群为研究标的，通过对其绝对或相对定量，进而对实验涉及的生物学问题进行验证。芳香族氨基酸代谢产生的单胺神经递质多巴胺（Dopamine）、去甲肾上腺素（Norepinephrine）、
5-羟色胺（5-HT）及其代谢终产物高香草酸（HVA）、 3,4-二羟基苯乙酸（DOPAC）、
5-羟基吲哚乙酸（5-HIAA），以及谷氨酸（Glutamate）及其脱羧生成的抑制递质γ-氨基丁酸（GABA），连同乙酰胆碱（Acetylcholine）、抗坏血酸（Ascorbic
acid）等小分子物质都是神经药理学领域中尤为关注的分析对象。高灵敏、高特异与快速地离体或在体定量测定脑脊液与脑微透析液中这类代谢物的准确含量，对于神经生物学研究意义重大。采用经典的电化学方法，囿于这类物质的酸碱性差异悬殊、基质干扰复杂等不利条件，常在方法特异性与分析通量上受到限制。而直接使用
HPLC-MS/MS 方法时，又面临色谱保留弱（反相分离RP）、基质干扰大、样品中缓冲盐浓度大、 ESI
电离效率低下（RP&亲水作用色谱 HILIC）等种种挑战。
利用 Thermo ScientificTM TSQ Quantum Access MAXTM LCMS/MS，本文报道了一种测定上述神经递质与相关代谢物含量的代谢靶标分析方法。采用苯甲酰化柱前衍生，本方法可有效提高强极性目标分析物的疏水性，并显著改善其 ESI 电离效率，从而有效克服复杂基质干扰，提高检测灵敏度，适用于神经生物学、临床样本检测、神经药效学评价等研究。
2. 实验部分
2.1 生物样品准备与衍生化：
小鼠脑脊液与脑微透析液样本由沈阳药科大学药理学教研室采集并提供，脑脊液使用乙腈脱蛋白，微透析液直接使用。衍生方法参考文献进行[1,2]，简述为：取适量样品置于尖头管中，按照1/2样品体积的比例，依次加入催化剂
100 mM 四氢硼酸盐缓冲液与衍生化试剂 5% 苯甲酰氯-乙腈溶液（V/V），涡旋混匀后室温下反应，离心取上清，供 HPLC-MS/MS
分析。抗坏血酸与乙酰胆碱，以及其余 8 种单胺神经递质与其代谢物的化学结构与衍生位点、反应途径见图1。
2.2 标准溶液配置：
取所有分析物混标母液，使用人工脑脊液逐级稀释至一定浓度后，按 2.1 项下描述进行苯甲酰化衍生。所得样品 HPLC-MS/MS 分析，外标法定量。
2.3 HPLC-MS/MS方法：
使用 Thermo Scientific AccelaTM 600 HPLC 进行分离， Thermo Scientific TSQ Quantum Access MAX 串联三重四极杆质谱检测方法使用 EZ Method 模式编辑，定时选择反应监测 timed SRM 主要参数见表 1，其余分析条件见表 2、 3。
2.4 数据处理:
采用 Thermo Scientific TraceFinderTM 软件（version 3.2）进行数据处理。
