ABI 8200 FMAT的理想替代技术：“混合即读一步法检测”模式 2
EGFR实验
抗EGFR抗体在培养基中梯度稀释，并添加20ul到384孔板中（Costar＃3712）。对于Mirrorball系统，暂停用CFSE标记A431细胞含有1 ×105个细胞/ mL和6nM抗鼠IgG AlexaFluor647二抗。对于ABI的8200平台，准备A431细胞的悬浮液包含4× 105细胞/ mL和6nM抗鼠IgG AlexaFluor647。首先，加入在各孔中加入20uL混合有荧光二抗的细胞悬液在37℃，孵育2小时。分别在Mirrorball和ABI8200平台上进行扫描并测定结合有EGFR抗体的细胞数量。最后，Mirrorball和ABI8200的浓度分别为2000细胞/孔和8000细胞/孔，3 nM抗体结合（图1）。
图1. Mirrorball表皮生长因子受体检测示意图。ABI 8200的实验protocol基本一致，除了加入的A431浓度为4 X 105细胞/ ml。
Mirrorball的数据扫描和获取
微孔板进行扫描，使用488和640纳米的指定激光器。每孔中的细胞都会 “on”使用TTP LabTech公司
ZL的阈值算法和两种形态荧光参数前面所述报告鲍文和卫理（1）。全井扫描和数据可视化中的各种方式，包括直方图或散点图，3D荧光强度分布，或整个以及使用Mirrorball的图像Cellista™软件。
ABI 8200的数据扫描和获取
使用640 nm激光扫描样品。进行细胞计数和荧光总强度导出到Excel文件和处理如 Lee et al（2）。实验数据仅仅收集了孔中心1 mm2的面积大小的区域。
数据结果
为了比较Mirrorball和ABI 8200在EGFR检测灵敏度方面的差异性，将A431细胞与梯度稀释的EGFR一抗以及AlexaFluor647标记的goat anti-mouse IgG二抗共同孵育。 在用Mirroball分析时，用CFSE对细胞进行染色，预先定位细胞并进行计数，细胞量为384孔板每孔2000个。对于ABI的8200， A431细胞量为每孔8000个接种。
图2表明，Mirroball检测灵敏度和ABI 8200 一样，从5 ng /ml抗EGFR抗体浓度开始，荧光随着浓度升高而逐渐加强。两种方法在一抗浓度高于100ng/ml的时候，都检测到了一个较强的荧光减少。这也是报道过的 “钩状效应”（2）。在这里，主要是过量的一抗过饱和了，阻止了荧光二抗的结合和最终的实验读数。
图2 抗EGFT抗体和 A431细胞结合的抗体浓度依赖的荧光强度曲线
Mirrorball的多激光能力提供了一个独有的优越性，对细胞的识别不会受到较低抗体结合的影响。而ABI 8200只配备了单一的640 nm激光，因此也只能检测高过背景的荧光。然而，在使用Mirrorball 时由于用CFSE（488nm）染料对细胞进行单独染色，细胞的计数就不再依赖荧光抗体的结合（图3）。可靠的细胞计数也同时增加了数据的稳健性。
