PCR Array 简单实用的检测基因表达的高通量方法（四）

RT²Profiler^TM PCR芯片特点灵敏度 研究者总是希望能检测到表达量相当低的基因，有时候，研究者得到的起始总RNA量也很少，但仍希望能进行实时定量PCR检测。为了满足研究者的这些需要，Superarray严格检测了PCR芯片系统的灵敏度。例如，Superarray使用PCR芯片检测了一系列总RNA样本，这些样本的浓度都不相同，使用的PCR芯片为炎症细胞因子和受体基因芯片，通常，这些基因的表达量都是很低的。图3将阳性信号的比例（Ct<35的基因所占百分比）与相应的总RNA量对应起来作图。结果表明，当起始的总RNA范围在5.0ng到1.0ug（甚至是5.0ug）时，每张PCR芯片的阳性信号比率均超过85%。对于表达量更高的基因，芯片检测的灵敏度还会大大提高，即在起始RNA量更低的情况下，芯片能够检测到的阳性信号比例更高。值得注意的是，起始的总RNA量最好不要低于0.5-1.0ug，否则会造成阳性信号损失。由于阳性信号比例在起始RNA量低时会显著下降，所以在实验中，检测的最低RNA量不少于5.0ng。    图3 当总RNA量低至5.0ng时，使用RT²Profiler^TM PCR芯片实验体系仍能获得很高的阳性信号比例。  RNA样品为XpressRef^TM人总RNA（GA-004），起始RNA量分别为0.1，1.0，5，10，50，100和1000ng）。芯片为炎症细胞因子和受体PCR芯片（APHS-011A）。采用RT² Real-Time^TM SYBR Green / 荧光素PCR反应体系（PA-011）。阳性信号的比例（Ct<35的基因所占的百分比）与对应的总RNA量做图。
特异性 PCR芯片体系的设计和优化都是针对基于SYBR green的实时定量PCR反应。由于SYBR  Green与非特异的双链DNA也会发生反应，为了获得高特异性，需要保证引物只扩增出特定的目的片段，从而使基于SYBR  Green的PCR芯片能够准确的检测基因表达水平。Superarray通过实验对设计合成的引物进行了验证，保证引物扩增的产物是单一的，基因特异性的，没有引物二聚体，也没有非特异性扩增产物。  下面是一个检测PCR芯片特异性的实验。检测PCR芯片中TGFβ和骨形成蛋白（BMP）家族各基因的熔解曲线，并且对PCR产物进行凝胶电泳实验，该家族的基因同源性很高。图4显示了BMP基因家族各基因扩增产物的熔解曲线和电泳结果。如图所示，各熔解曲线均为单峰，电泳条带亦单一，并且条带大小与预期值一致。结果表明，  PCR 芯片扩增出基因产物特异性高，即使相同RNA样品中同一基因家族的同源基因也可以区别。优化的体系在SYBR  Green检测中表现出高特异性，而这种特异性通常被认为只能在使用更加昂贵的基于探针的方法才能获得。   图4 PCR芯片的高特异性  RT²Profiler^TM PCR芯片对所检测的基因显示出高特异性  
RNA样品为XpressRef^TM人总RNA（GA-004，5ug），PCR芯片为人TGFb/BMP信号通路PCR 芯片（APH-035A），采用RT² Real-Time^TM SYBR Green / 荧光素PCR反应体系（PA-011）。通过标准熔解反应步骤获得熔解曲线（A），产物进一步通过琼脂糖凝胶电泳检测（B）。