藻类多糖的结构与生物活性研究实验

实验材料 大型藻类

试剂、试剂盒 NaNO；Na2HPO4•12H2O；EDTA

仪器、耗材 偏光光度计；高效液相色谱仪

实验步骤

（1）多糖的纯化是将离心分离出的1000 ml培养液，用40℃真空浓缩到50 ml，再移入到透析袋内于4 ℃蒸馏水中透析三天。早晚更换一次蒸馏水，将透析袋内液体倒入烧杯，边搅拌边加入4倍体积99%乙醇，4 ℃过夜。11000 r/min离心得到沉淀，冷冻干燥获得粗多糖。经DEAE-sephacel柱层析，0～2 mol/L氯化钠梯度洗脱进一步纯化，纯度以醋酸纤维薄膜电泳法[1]鉴定。

（2）分子量的测定是使用TSK-GEL.G300SWXL（7.8 mm×300 mm柱）GPC的高效液相层析（HPLC）法。移动相为1%三己基胺，检测使用示差屈折计（YRU-880RI-UI检测器），同样条件下以Pulluna-ShodexSTANDARDP-82（分子量分别为5.9，11.8，22.8，47.8，112，212，404，788 kU）为标准。

（3）粘度使用TokimecEMD回转粘度计测定，测定条件为25 ℃，回转锥形种类是1°34′，糖浓度为0.5%。

（4）旋光度使用JASCO.DIP-370偏光光度计测定，测定条件是16.9 ℃，糖浓度是0.24%。

（5）元素分析采用的是原子光谱吸收法。

（6）硫酸基定量采用Rhodizonicacid法[2]。

（7）薄层层析是将多糖完全水解后，取0.5 ml过微量树脂Dowex1（乙酸型）柱，先用纯水洗脱，收集中性部分，再用0.2 mol/L乙酸洗脱，收集酸性部分，点样于硅胶板（Kieselgel60，10×10 cm）上，使用展开剂（醋酸乙酯∶醋酸∶水=2∶1∶1）展开，50%硫酸喷雾后，100 ℃使其炭化，根据炭化斑点的 Rf 值鉴定糖类。

（8）气相层析是把多糖1 mg用三氟乙酸完全水解后，制成糖醇-乙酰化诱导体后进行的，实验条件为TC-I柱（0.25 mm×20 mm），气化室温度：230 ℃，柱温：140～210 ℃，以1.3 ℃/min升温，载气为氮气，氢离子炎检测。

（9）糖醛酸的定量采用Sulfatedacid-carbazole反应法[3]测定。

（10）H1-NMR光谱分析是将纯多糖溶解于重水，冷冻干燥，重复两次，以丙酮δ2.23为内部标准。光谱是在用质子照射和费林变换装备完全的INOVA-600光谱仪，600 MHz、20 ℃条件下测定的。

将不同组分的多糖或寡糖进行生物活性分析，有活性的进行结构分析。

其他

[1] Nihonkagakukai , Saccharo-chemstry (lower) , Tokyoukagakudojin, 148～149 , 1976

[2 ] Louis J . Silverstri , Analysis of sulfate in complex carbohydrates, Ana . Biochen ., 123 , 303～309 , 1982

[3 ] Midori K . Physics and Chemistry Dictionary , IwanamiBookshop , 47 , 1981