大规模培养常用方法（贴壁培养、悬浮培养与固定化培...-2
大规模培养常用方法（贴壁培养、悬浮培养与固定化培养）-2
CelliGen、 CelliGen PlusTM和Bioflo3000反应器是常用的贴壁培养式生物反应器，用于细胞贴壁培养时可用篮式搅拌系统和圆盘状载体。此载体是直径6毫米无纺聚酯纤维圆片，具很高表面积与体积比（1200cm2/g），利于获得高细胞密度。篮式搅拌系统和载体培养是目前贴壁细胞培养使用最多方式，用于杂交瘤细胞、Hela细胞、293细胞、CHO细胞及其它细胞培养。此种方式培养细胞，细胞接种后贴壁快。
三、悬浮培养（suspension culture）：是指细胞在反应器中自由悬浮生长的过程。主要用于非贴壁依赖型细胞培养，如杂交瘤细胞等；是在微生物发酵的基础上发通起来的。
无血清悬浮培养是用已知人源或动物来源的蛋白或激素代替动物血清的一种细胞培养方式，它能减少后期纯化工作，提高产品质量，正逐渐成为动物细胞大规模培养的研究新方向。
四、固定化培养（immobilization culture）：是将动物细胞与水不溶性载体结合起来，再进行培养。上述两大类细胞都适用，具有细胞生长密度高，抗剪切力和抗污染能力强等优点，细胞易于产物分开，有利于产物分离纯化。制备方法很多，包括吸附法、共价贴附法、离子/共价交联法、包埋法、微囊法等。
1.吸附法:用固体吸附剂将细胞吸附在其表面而使细胞固定化的方法称为吸附法（adhesion）。操作操简便、条件温和、是动物细胞固定化中最早研究使用的方法。缺点是：载体的负荷能力低，细胞易脱落。微载体培养和中空纤维培养是该方法的代表，稍后专门介绍。
2. 共价贴附法:利用共价键将动物细胞与固相载体结合的固定化方法称为共价贴附法（attachment by covalent bonding）。此法可减少细胞的泄漏，但须引入化学试剂，对细胞活性有影响，且因贴附而导致扩散限制小，细胞得不到保护。
3. 离子/共价交联法:双功能试剂处理细胞悬浮液，会在细胞间形成桥而絮结产生交交联作用，此固定化细胞方法称为离子/共价交联法（cross- linking by covalent bonding）。交联试剂会使一些细胞死亡，也会产生扩散限制。
4.包埋法:将细胞包埋在多孔载体内部制成固定化细胞的方法称为包埋法（entrapment）。优点是：步骤简便、条件温和、负荷量大、细胞泄漏少，抗机械剪切。缺点是：扩散限制，并非所有细胞都处于最佳基质浓度，且大分子基质不能渗透到高聚物网络内部。一般适用于非贴壁依赖型细胞的固定化，常用载体为多孔凝胶，如琼脂糖凝胶、海藻酸钙凝胶和血纤维蛋白。
5.微囊法（microencapsulation）:是用一层亲水的半透膜将细胞包围在珠状的微囊里，细胞不能逸出，但小分子物质及营养物质可自由出入半透膜；囊内是种微小培养环境，与液体培养相似，能保护细胞少受损伤，故细胞生长好、密度高。微囊直径控制在200-400μm为宜。制备中应注意：
●温和、快速、不损伤细胞，尽量在液体和生理条件下操作；
●所用试剂和膜材料对细胞无毒害；
●膜的孔径可控制，必须使营养物和代谢物自由通过；
●膜应有足够机械强度抵抗培养中搅拌。
五、抗凋亡策略在细胞大规模培养中的应用
生物反应器动物细胞大规模生产过程中，细胞凋亡在细胞死亡中占主要部分。最近研究显示在大规模培养生物反应器中细胞的死亡中80%是凋亡所导致,而不是以前所认为的坏死。而在大规模细胞培养中，细胞死亡是维持细胞高活性和高密度的最大障碍。理论上讲，防止或延长细胞死亡，可以极大提高生物反应器生产重组蛋白的产量。
细胞凋亡由一系列基因精确地调控，是多细胞生物发育和维持稳态所必需的生理现象。已知凋亡的最终执行者是Caspase家族，它们均为半胱氨酸蛋白酶，各识别一个4氨基酸序列，并在识别序列C端天冬氨酸残基处将底物切断。Caspase含有可被自身识别的序列，可以切割活化自身而导致信号放大，并作用于下游Caspase成员，从而形成Caspase家族的级联放大，最终作用于效应蛋白，引起细胞凋亡。
所以在大规模培养时干扰细胞在培养中凋亡的发生，提高细胞特异性抵制遇到压力而引起凋亡的能力，有利于提高细胞的培养密度、延长细胞的培养周期，从而提高目标产品的产量2-3倍。
1.营养物质抗凋亡
在常规生物反应器构造中，营养耗竭或缺乏培养基中特殊的生长因子则引起凋亡，例如血清，糖或特殊氨基酸的耗尽。培养基中添加氨基酸或其它关键营养可抑制凋亡、延长培养时间从而提高产品的生产。大规模培养中细胞凋亡主要由于营养物质的耗竭或代谢产物的堆积引起，如谷氨酰胺的耗竭是最常见的凋亡原因，而且凋亡一旦发生，补加谷氨酰胺已不能逆转凋亡。另外，动物细胞在无血清、无蛋白培养基中进行培养时，细胞变得更为脆弱，更容易发生凋亡。
2.基因抗凋亡
与凋亡相关的一系列基因产物可对其进行正、负向的调控，因此可通过导入相应基因来调节细胞凋亡的机制。Bcl-2基因是目前最为有效的抗凋亡基因，在多种细胞系中均表现出很强的抗凋亡活性。
3.化学方法抗凋亡
凋亡发生时细胞许多部位发生生化物质的改变，有些变化如改变细胞氧化还原条件产生活性氧在凋亡信号阶段发生，其它的如破坏线粒体膜电位、激活
caspase则发生在凋亡效应阶段，这在绝大多数细胞死亡中是相同的。因此,阻止这些生化物质的改变可能阻止或至少延迟细胞凋亡的发生，运用化学物质可抑制信号效应阶段的发生，被认为是抗调亡策略之一。
