RNA的电泳，转膜和杂交
实验原理：
基本同 Southern Blotting，但因RNA 是单链分子，必须消除局部区域形成的二级结构，在电场中泳动的距离才能反映它本身的大小，因而需使用变性胶进行电泳；另应特别注意防止RNA 的降解。
实验材料：
经检测质量好的 RNA
实验步骤：
1．制胶：
Agarose 1%-1.2% ， 1×MOPS buffer 。
用灭菌的 DEPC 水定容，加热融化，冷却至 70℃ 加甲醛，使终浓度为 2% ，通风橱中放 1hr 。
2．准备电泳液： 1×MOPS buffer （小号槽约配 500ml ，中号槽约配 900ml ）
3．制样：测好浓度后按以下体系加样 :
15μg RNA+ 灭菌的 DEPC 水 10ul
Sample buffer 8ul
loading buffer 2ul
EB (10mg/ml, 专用于 RNA) 0.03ul
65℃ 水浴变性 10min ，立即放冰上，直至点样
4．点样：点样要仔细，不要漏出，并记住点样顺序
5．电泳：中号槽：电压 100V 电泳 1hr 左右，至溴酚兰离点样孔约 3.5-4cm （凝胶在紫外灯下可看到 28S 和 18S 刚好分开即可）
6．转膜：转膜液用 500ml 4×SSC 加 27ml 37% 甲醛（终浓度为 2% ）；转膜步骤同 Southern 。注意加溶液后一切操作均在通风橱内进行，以避免甲醛对人体的伤害
7．照相：将胶及膜取下，分别在凝胶成像系统下看胶上 RNA 是否有残留，膜上RNA 效果是否完好。
8．风干：在超净工作台上吹干。
9．固定：于紫外交联仪内以 1200 ENERGY 照一次约半分钟，再重复一次，再在超净工作台上吹干。
10．预杂交：在杂交管内加约 50ml 杂交液，将膜卷起放入，注意 RNA 面朝内，于 64℃ 预杂交 1-4hrs
11．探针准备：预先挖胶回收的 PCR 产物或酶切产物（ better ），测浓度，跑胶验证后，按以下体系加入：
DNA 3ul （约 200ng ）
ddH2O 10ul
dNTP （ 1.67mM ） 4ul
杂交 Buffer 10ul
Klenow Fragment 2ul
α-dCTP* 5ul
先加入 DNA 和 ddH2O ，100℃ 变性 10min ，冰上放 5min ，再加入 dNTP和杂交 primer ，加酶时注意低温操作，先加在管壁上， 立即到同位素室加同位素，混匀离心，于室温下反应半小时。
12．探针纯化：在原反应体系中继续加入：
ddH2O 66ul ； NaAc 10ul ；
无水乙醇 250ul
混匀离心 5min，12000rpm，倒上清加 500ul 无水乙醇洗，离心 2min ，12000rpm，倒上清，测信号，达 103-104
较好，加 40ul ddH 2O 和 400ul 杂交液之后混匀离心，于 100℃ 变性 10min，冰上放 5min
13．加探针：取出杂交管倒去杂交液，加入 15ml 杂交液，将探针加入，盖紧，于 64℃ 杂交过夜
14．洗膜，压片：将杂交管中液体倒出，先加少量洗膜液 Ⅰ ，冷洗 5min ，倒出，再多加些洗膜液 Ⅰ ，冷洗 10min
，将膜取出测信号，根据信号大小决定是否热洗，若信号高，用洗膜液 Ⅱ ， Ⅲ
继续洗，直到信号值达到适宜值为止，即膜上某一区域信号强，而其他区域信号弱代表杂交上了，然后包膜压片，放于-20℃ 或 -80℃ 3 天左右即可洗
X 片。
15．结果观察与分析
