科研入门基础实验之qRT-PCR

2020年10月16日 16:12:18 来源: 互联网
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  这个假期太长,长的我差点忘了自己之前是做啥课题的,直到和某个zz一起玩公众号,商量着Ta负责生信领域,我负责实验部分,各取所长,想想也未尝不可,那就姑且试试吧。

  接下来我开始用力回忆当初最先学的实验是啥?对,是逆转录定量 PCR(qRT-PCR)!

  首先来了解qRT-PCR的流程:提取组织/细胞总RNA,以其中的mRNA为模板,利用逆转录酶反转录成cDNA,再进行PCR扩增,通过计算2-ΔΔCt值获得基因表达。归根结底,PCR验证的是基因表达水平。

  那我们要怎样开始这个实验呢?下面假设我后天就要跑一轮PCR。为什么要后天?因为你明天要提RNA 啊,哈哈。

  我现在有两个组,对照组和实验组。首先我们要提取RNA和检测RNA浓度。

  我们都习惯在冰上操作,因为可以防止一部分RNA降解。需要注意的是该过程用到的器械需经灭菌消毒且不能交叉使用,EP管、枪头等也需无菌无核酸酶。佩戴好手套口罩,避免污染。严格按照实验标准操作!

  然后逆转录。常用的是Takara和罗氏逆转录试剂盒,在这里以比较实惠的Takara试剂盒为例。将1ugRNA根据如下体系(20ul)和程序逆转为cDNA。

  取出cDNA后加入180ulddH2O于-20℃保存待用。逆转录是傻瓜式操作,按照说明书做就行,没有什么特别容易失误的地方,这里不啰嗦了。

  最后PCR扩增。

  取稀释10倍的cDNA2.5ul,荧光染料SYBER Green5ul,浓度为30uM的上下游引物各0.5ul和DEPC水1.5ul,构成10ul体系进行扩增,每个样重复3次。参考基因GAPDH或β-actin,假设有目的基因Kiss1、GPR54、GnRH

  PS:引物一般通过参考文献或者PrimerBank确定,一定要核对引物来源是否与自己的样本一致(Human、Mouse、Rat.......)

  数据导入Graphpad Prism作图即可看出与正常组相比,目的基因在实验组的表达情况,再进行统计学分析即可。

  PCR说简单也简单,说难也难,最主要的还是要细心、耐心。idea可以创新,但是实验方法只有不断地重复。这里只是粗暴的介绍了整个实验流程,让大家稍微有个概念,具体如何操作还是要请教身边的老师和同门,毕竟实验样本诚可贵,可别轻易祸祸了,哈哈。


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