聚合酶链反应(PCR)详细实验操作步骤
一、实验原理
聚合酶链反应(PCR)技术是在体外进行的由引物介导的酶促DNA扩增反应。PCR的原理是在模板DNA、PCR引物、四种脱氧核糖核苷酸(dNTP)及适当浓度的Mg2+存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的体外酶促合成反应。两个引物分别位于靶序列两端，同两条模板的3’端互补，由此限定扩增片段。PCR反应由一系列的变性→退火→延伸反复循环构成，即在高温下模板双链DNA变性解链，然后在较低温度下同过量引物退火，再在适中温度下由DNA聚合酶催化进行延伸。理论上，经过N次循环可使特定片段扩增到2n-1，考虑到扩增效率达不到100%，所以通常经25到30次循环可扩增到106倍，足够后续实验展开。
二、实验材料
表1 实验材料
名称来源PCR仪Eppendorf高速冷冻离心机Eppendorf电泳仪BIO-RAD (mini protean 3 cell)凝胶成像仪CliNx电泳级琼脂糖BIOWESTGenGreen核酸染料Genview2*PCR MixTAKARA引物杭州擎科
三、实验方法
1) 取灭菌的Ep管，加入表2中所列试剂，建立20μL反应体系，离心5s混匀，其中市售的2×PCR Mix中已包含dNTP、Mg2+及DNA聚合酶，无需再次加入；
表2 PCR体系
体系体积 (μL)2×PCR Mix1010 µM正向引物0.510 µM反向引物0.5无菌水7模板2
2) 按表3所列扩增条件设置PCR仪参数，其中最佳退火温度由引物Tm决定，也直接可用55℃作为退火温度，循环所用的延伸时间则根据目的基因长度及DNA聚合酶性能确定，一般为每分钟1000 bp；
表3 PCR体系和条件
温度时间95℃5 min95℃30 s55℃或待定30 s72℃待定30 Cycles 72℃10 min4℃∞
3) 取5μL扩增产物用1%琼脂糖胶进行电泳分析，检查反应产物及长度。
四、常见问题分析与解决方法
1. 无扩增条带：
1) 酶失活或在反应体系中未加入酶。Taq DNA聚合酶因保存或运输不当而失活，往往通过更换新酶或用另一来源的酶以获得满意的结果。
2) 模板含有杂质。特别是对甲醛固定及石蜡包埋的组织常含甲酸，造成DNA脱嘌呤而影响PCR的结果。
3) 变性温度是否准确：PCR仪指示温度与实际温度是否相符，过高酶在前几个循环就迅速失活；过低则模板变性不彻底。
4) 反应系统中污染了蛋白酶及核酸酶，应在未加Taq酶以前，将反应体系95℃加热5-10 min。
5) 引物变质失效。人工合成的引物是否正确。是否纯化，或因储存条件不当而失活。
6) 引物错误。利用BLAST检查引物特异性或重新设计引物。
7) DNA凝胶电泳时加入阳性对照，确保不是DNA凝胶和PCR程序的问题。
2. PCR产物量过少：
1) 退火温度不合适。以2度为梯度设计梯度PCR反应优化退火温度。
2) DNA模板量太少。增加DNA模板量。
3) PCR循环数不足。增加反应循环数。
4) 引物量不足。增加体系中引物含量。
5) 延伸时间太短。以1 kb/min的原则设置延伸时间。
6) 变性时间过长。变性时间过长会导致DNA聚合酶失活。DNA模板中存在抑制剂。确保DNA模板干净。
3. 扩增产物在凝胶中涂布或成片状条带弥散
1) 酶量过高。减少酶量；酶的质量差，调换另一来源的酶。
2) dNTP浓度过高。减少dNTP的浓度。
3) MgCl2浓度过高。可适当降低其用量。
4) 模板量过多。质粒DNA的用量应<50 ng，而基因组DNA则应<200 ng。
5) 引物浓度不够优化。对引物进行梯度稀释重复PCR反应。
6) 循环次数过多；增加模板量减少循环次数至30，缩短退火时间及延伸时间，或改用二种温度的PCR循环。
7) 退火温度过低。
8) 电泳体系有问题：
①凝胶中缓冲液和电泳缓冲液浓度相差太大；
②凝胶没有凝固好；
③琼脂糖质量差。
9）若为PCR试剂盒则可能：
①
由于运输储存不当引起试剂盒失效；
②
试剂盒本身质量有问题，如引物选择、循环参数等选择不当。
10）降解的陈旧模板扩增也易产生涂布。
4. 扩增产物出现多条带(杂带)
1) 引物用量偏大，引物的特异性不高。应调换引物或降低引物的使用量。
2) 循环的次数过多。适当增加模板的量，减少循环次数。
3) 酶的用量偏高或酶的质量不好，应降低酶量或调换另一来源的酶。
4) 退火温度偏低，退火及延伸时间偏长。应提高退火温度，减少变性与延伸时间，也可采用二种温度的PCR扩增。以2度为梯度设计梯度PCR反应优化退火温度。
5) 样品处理不当。
6) Mg2+浓度偏高，因适当调整Mg2+使用浓度。
7) 若为PCR试剂盒，也可能时试剂盒本身质量有问题。
8) 复制提前终止。使用非热启动的聚合酶时常有发生。冰上准备反应体系或采用热启动聚合酶。
9) 反应缓冲液未完全融化或未充分混匀。确保反应缓冲液融化完全并彻底混匀。
10) 引物特异性差。利用BLAST检查引物特异性或重新设计引物。
11) 引物量过多。减少反应体系中引物的用量。
12) 模板量过多。质粒DNA的用量应<50ng，而基因组DNA则应<200ng。
13) 外源DNA污染。确保操作的洁净。
5. 阴性对照出现条带：
试剂，枪头，工作台污染。使用全新的试剂和枪头，对工作台进行清洁。
6. 条带大小与理论不符：
1) 污染。使用全新的试剂和枪头，对工作台进行清洁。
2) 模板或引物使用错误。更换引物和模板。
3) 基因亚型。对研究的基因进行序列分析和BLAST研究。
