CTAB 法从干燥材料中提取DNA的方法

从干燥材料中提取

(1)粗提

①试剂

a.1倍 CTAB 提取缓冲液:2倍 CTAB 贮存液稀释1倍,使用前每100mL 加入巯基乙醇0.14mL。

b.其他试剂与从新鲜材料中提取相同。

②操作

a.称取 1g 干燥材料置研钵中,加入3～4g 铝粉研磨。

b.将粉末转入离心管中,加入0.6～15mL 1倍 CTAB 提取缓冲液,轻缓地搅拌,使材料充分分散。置56℃水浴中保温10～20min。

c.冷却至室温,加入等体积氯仿/异戊醇,颠倒离心管混匀。20℃、8000离心力离心10min。

d.将上相转入另一离心管中,加入0.1体积的10% CTAB 溶液,轻轻混合,重复c,d操作。

e.加入等体积的1倍 CTAB 沉淀缓冲液轻轻混匀,室温下放置 30min 或更长。

f.室温条件下,1500离心力离心10min,去上清液,沉淀纯化。

(2)粗提物的纯化

①小量制备物的纯化

试剂

a.Imol/L NaCl。

b.65%,80%无水乙醇。

操作

a.将沉淀溶于 400L 1mol/L NaCl 中可置56℃水浴中助溶。

b.加入2倍体积的无水乙醇,于一70沉淀30min,或20℃过夜。

c.15000r/min 离心2min。去上清液。

d.先后用65%,80%乙醇,漂洗沉淀,吹干,溶于无菌蒸馏水中。

②大量制备物的纯化

试剂

a.1mol/L CsCl/EB溶液:50mmol/L Tris·Cl(pH8.0),10 mmol/L EDTA,1 mol/L CsCl,0.2mg/mL EB。

b.7mol/L CSCl/EB 溶液:7mol/L CsCl,0.1%sarkosyl,0.2mg/mL EB。

操作

a.向沉淀加入 2.4mmol/L CsCl/EB 溶液,于56℃水浴中溶解。

b.将溶液转入到 Beckman VTi65 超速离心管(或其他可替代的离心管)中,加入2.9mL7mol/L CsCl/EB 溶液,平衡,密封管口,轻轻倒置混合。

c.用 VTi65 转子58000r/min 离心4h,或40000r/min 离心16h。

d.320nm 紫外光照射下观察 DNA 的红色带,用16号针头的1mL 注射器从离心管侧面穿刺抽取 DNA。

e.用 CsCl 饱和的异丙醇反复抽提 DNA,至抽提液无明显红色(去除EB)。

f.将 DNA 样品置透析袋中,于4℃蒸馏水中透析24h,其间更换蒸馏水3～4次。

g.透析液转入离心管中,加入1/10体积的3mol 二乙酸钠,及2倍体积的冷乙醇,混匀,于20℃沉淀过夜(或-70℃放置30min)。

h.80000离心力离心15min,去上清液真空干燥 DNA 沉淀。用适量的 TE 溶解。

3、说明
使用 CTAB 法时,操作中需要注意如下问题。

(1)最好使用幼嫩的材料,材料含水量大时,可用70%乙醇擦拭,蒸馏水稍冲洗后用滤纸吸干,于液氮中研磨。如果材料量大(20g以上),或所用的植物材料较老,或材料含有较多的酚类物质,应提高β-巯基乙醇的用量。

(2)氯仿抽提时,要保证抽提液中有一定的盐浓度,否则 DNA 进入沉淀。

(3)CTAB 溶液在15℃以下会沉淀,因此离心和其他操作时不可在低温下进行。

(4)加入沉淀缓冲液应在高于15℃的室温下沉淀,如果室温适宜,沉淀时间足够而无沉淀出现,可能是盐浓度高,这时可再加入沉淀缓冲液降低盐浓度。离心收集 CTAB 沉淀缓冲液沉淀的 DNA 时,不能离心过度,高速度及长时间的离心都会使沉淀过紧,而再溶解困难。

(5)采用真空抽干沉淀时,不能抽得太干抽得太干会使 DNA 断裂,也可不采用真空抽干,将离心管置通风柜或超净工作台中令乙醇自然蒸干,这样对 DNA 造成的损伤小。

(6)10%的 CTAB 溶液很粘滞,取液时可将其加热至56℃。

(7)转移 DNA 溶液用的枪头要剪去尖,避免对 DNA 的机械损伤。

(8)所得 DNA 应为白色或灰白色,若呈褐色则有多酚物质污染。对于含多酚类物质多的材料,提取缓冲液中可加入1%的 PVP。对于多糖含量高的材料,提取液中 CTAB 的浓度可增至3%或更高。