高通量测序(NGS)的过程及原理介绍
高通量测序技术的一般过程是将DNA（或cDNA）随机片段化，加上接头序列，制备用于上机测序的文库，通过对文库中数以万计的克隆（colony）进行延伸反应，检测对应的信号获取序列信息，最终通过数据分析来挖掘序列中的科学问题。
几种不同测序平台的原理及步骤如下：
（1）Roche 454平台
Roche 454测序系统是第一个商业化运营二代测序技术的平台，也是首选将焦磷酸测序应用在测序技术上的平台。测序原理如下：
1）DNA文库制备
454测序系统的文件构建方式和illumina的不同，它是利用喷雾法将待测DNA打断成300-800bp长的小片段，并在片段两端加上不同的接头，或将待测DNA变性后用杂交引物进行PCR扩增，连接载体，构建单链DNA文库。
2）Emulsion PCR （乳液PCR，其实是一个注水到油的独特过程）
454当然DNA扩增过程也和illumina的截然不同，它将这些单链DNA结合在水油包被的直径约28um的磁珠上，并在其上面孵育、退火。
乳液PCR最大的特点是可以形成数目庞大的独立反应空间以进行DNA扩增。其关键技术是“注水到油”（水包油），基本过程是在PCR反应前，将包含PCR所有反应成分的水溶液注入到高速旋转的矿物油表面，水溶液瞬间形成无数个被矿物油包裹的小水滴。这些小水滴就构成了独立的PCR反应空间。理想状态下，每个小水滴只含一个DNA模板和一个磁珠。
这些被小水滴包被的磁珠表面含有与接头互补的DNA序列，因此这些单链DNA序列能够特异地结合在磁珠上。同时孵育体系中含有PCR反应试剂，所以保证了每个与磁珠结合的小片段都能独立进行PCR扩增，并且扩增产物仍可以结合到磁珠上。当反应完成后，可以破坏孵育体系并将带有DNA的磁珠富集下来。进过扩增，每个小片段都将被扩增约100万倍，从而达到下一步测序所要求的DNA量。
3）焦磷酸测序
测序前需要先用一种聚合酶和单链结合蛋白处理带有DNA的磁珠，接着将磁珠放在一种PTP平板上。这种平板上特制有许多直径约为44um的小孔，每个小孔仅能容纳一个磁珠，通过这种方法来固定每个磁珠的位置，以便检测接下来的测序反应过程。
测序方法采用焦磷酸测序法，将一种比PTP板上小孔直径更小的磁珠放入小孔中，启动测序反应。测序反应以磁珠上大量扩增出的单链DNA为模板，每次反应加入一种dNTP进行合成反应。如果dNTP能与待测序列配对，则会在合成后释放焦磷酸基团。释放的焦磷酸基团会与反应体系中的ATP硫酸化学酶反应生成ATP。生成的ATP和荧光素酶共同氧化使测序反应中的荧光素分子并发出荧光，同时由PTP板另一侧的CCD照相机记录，最后通过计算机进行光信号处理而获得最终的测序结果。由于每一种dNTP在反应中产生的荧光颜色不同，因此可以根据荧光的颜色来判断被测分子的序列。反应结束后，游离的dNTP会在双磷酸酶的作用下降解ATP，从而导致荧光淬灭，以便使测序反应进入下一个循环。
由于454测序技术中，每个测序反应都在PTP板上独立的小孔中进行，因而能大大降低相互间的干扰和测序偏差。454技术最大的优势在于其能获得较长的测序读长，当前454技术的平均读长可达400bp，并且454技术和illumina的Solexa和Hiseq技术不同，它最主要的一个缺点是无法准确测量同聚物的长度，如当序列中存在类似于PolyA的情况时，测序反应会一次加入多个T，而所加入的T的个数只能通过荧光强度推测获得，这就有可能导致结果不准确。也正是由于这一原因，454技术会在测序过程中引入插入和缺失的测序错误。
（2）Illumina Solexa平台
Illumina公司的Solexa和Hiseq应该说是目前全球使用量最大的第二代测序机器，这两个系列的技术核心原理是相同的，都是采用边合成边测序的方法，它的测序过程主要分为以下4步：
Illumina Solexa原理：桥式PCR+4色荧光可逆终止+激光扫描成像
①DNA文库制备——超声打断加接头
利用超声波把待测的DNA样本打断成小片段，目前除了组装之外和一些其他的特殊要求之外，主要是打断成200-500bp长的序列片段，并在这些小片段的两端添加上不同的接头，构建出单链DNA文库。
②Flowcell——吸附流动DNA片段
Flowcell是用于吸附流动DNA片段的槽道，当文库建好后，这些文库中的DNA在通过flowcell的时候会随机附着在flowcell表面的channel上。每个Flowcell有8个channel，每个channel的表面都附有很多接头，这些接头能和建库过程中加在DNA片段两端的接头相互配对（这就是为什么flowcell能吸附建库后的DNA的原因），并能支持DNA在其表面进行桥式PCR的扩增。这样就形成了数千份相同的单分子簇，被用做测序模板。
③桥式PCR扩增与变性——放大信号
桥式PCR以Flowcell表面所固定的接头为模板，进行桥形扩增，如图4.a所示。经过不断的扩增和变性循环，最终每个DNA片段都将在各自的位置上集中成束，每一个束都含有单个DNA模板的很多分拷贝，进行这一过程的目的在于实现将碱基的信号强度放大，以达到测序所需的信号要求。
④测序——测序碱基转化为光学信号
测序方法采用边合成边测序的方法。向反应体系中同时添加DNA聚合酶、接头引物和带有碱基特异荧光标记的4中dNTP（如同Sanger测序法）。这些dNTP的3’-OH被化学方法所保护，因而每次只能添加一个dNTP。在dNTP被添加到合成链上后，所有未使用的游离dNTP和DNA聚合酶会被洗脱掉。接着，再加入激发荧光所需的缓冲液，用激光激发荧光信号，并有光学设备完成荧光信号的记录，最后利用计算机分析将光学信号转化为测序碱基。这样荧光信号记录完成后，再加入化学试剂淬灭荧光信号并去除dNTP 3’-OH保护基团，以便能进行下一轮的测序反应。Illumina的这种测序技术每次只添加一个dNTP的特点能够很好的地解决同聚物长度的准确测量问题，它的主要测序错误来源是碱基的替换，目前它的测序错误率在1%-1.5%之间，测序周期以人类基因组重测序为例，30x测序深度大约为1周。
（3）ABI Solid平台
Solid测序技术是ABI公司于2007年开始投入用于商业测序应用的仪器。它基于连接酶法，即利用DNA连接酶在连接过程之中测序，其流程及原理如下：
1）DNA文库构建
片段打断并在片段两端加上测序接头，连接载体，构建单链DNA文库。
2）Emulsion PCR
Solid的PCR过程也和454的方法类似，同样采用小水滴emulsion PCR，但这些微珠比起454系统来说则要小得多，只有1um。在扩增的同时对扩增产物的3’端进行修饰，这是为下一步的测序过程作的准备。3’修饰的微珠会被沉积在一块玻片上。在微珠上样的过程中，沉积小室将每张玻片分成1个、4个或8个测序区域（图6-a）。Solid系统最大的优点就是每张玻片能容纳比454更高密度的微珠，在同一系统中轻松实现更高的通量。
3）连接酶测序
这一步是Solid测序的独特之处。它并没有采用以前测序时所常用的DNA聚合酶，而是采用了连接酶。Solid连接反应的底物是8碱基单链荧光探针混合物，这里将其简单表示为：3’-XXnnnzzz-5’。连接反应中，这些探针按照碱基互补规则与单链DNA模板链配对。探针的5’末端分别标记了CY5、Texas Red、CY3、6-FAM这4种颜色的荧光染料（图6-a）。这个8碱基单链荧光探针中，第1和第2位碱基（XX）上的碱基是确定的，并根据种类的不同在6-8位（zzz）上加上了不同的荧光标记。这是Solid的独特测序法，两个碱基确定一个荧光信号，相当于一次能决定两个碱基。这种测序方法也称之为两碱基测序法。当荧光探针能够与DNA模板链配对而连接上时，就会发出代表第1，2位碱基的荧光信号，图6-a和图6-b中的比色版所表示的是第1，2位碱基的不同组合与荧光颜色的关系。在记录下荧光信号后，通过化学方法在第5和第6位碱基之间进行切割，这样就能移除荧光信号，以便进行下一个位置的测序。不过值得注意的是，通过这种测序方法，每次测序的位置都相差5位。即第一次是第1、2位，第二次是第6、7位……在测到末尾后，要将新合成的链变性，洗脱。接着用引物n-1进行第二轮测序。引物n-1与引物n的区别是，二者在与接头配对的位置上相差一个碱基（图6-a. 8）。也即是，通过引物n-1在引物n的基础上将测序位置往3’端移动一个碱基位置，因而就能测定第0、1位和第5、6位……第二轮测序完成，依此类推，直至第五轮测序，最终可以完成所有位置的碱基测序，并且每个位置的碱基均被检测了两次。该技术的读长在2×50bp，后续序列拼接同样比较复杂。由于双次检测，这一技术的原始测序准确性高达99.94%，而15x覆盖率时的准确性更是达到了99.999%，应该说是目前第二代测序技术中准确性最高的了。但在荧光解码阶段，鉴于其是双碱基确定一个荧光信号，因而一旦发生错误就容易产生连锁的解码错误。
（4）Thermo Fisher Scientific Ion Torrent平台
Ion Torrent 测序仪是第一个不需要光学系统的商业测序仪，所采用的技术为半导体测序，通过半导体芯片直接将化学信号转换为数字信号，不同于前面提到的任何测序仪，可以称之为“二代半”测序仪。其测序原理如下：
该技术使用了一种布满小孔的高密度半导体芯片，一个小孔就是一个测序反应池。在半导体芯片的微孔中固定DNA链，随后依次掺入ACGT，当DNA聚合酶把核苷酸聚合到延伸中的DNA链上时，会释放出一个氢离子，反应池中的PH发生改变，位于池下的离子感受器感受到H+离子信号，H+离子信号再直接转化为数字信号，从而读出DNA序列。如果检测的DNA链上有两个相同的碱基，将会检测到电压双倍，芯片则记录两个相同的碱基。
a.测序流程图，b.文库制备，c.乳液PCR（前三个步骤与454技术类似），d. 测序过程
Ion Torrent半导体测序技术的发明人也是454测序技术的发明人之一——Jonathan Rothberg，它的文库和样本制备跟454技术很像，甚至可以说就是454的翻版，只是测序过程中不是通过检测焦磷酸荧光显色，而是通过检测H+信号的变化来获得序列碱基信息。由于对对个相同碱基的判读是通过电信号来传导，Ion Torrent平台在聚合酶上进行了优化，新推出的Hi-Q酶聚合反应非常快，它产生的PH值变化的峰更高、更尖、更利于判读，这在很大程度上提高了Ion Torrent测序仪判读Homoploymer区域时的准确性。
Ion Torrent相比于其他测序技术来说，不需要昂贵的物理成像等设备，因此，成本相对来说会低，体积也会比较小，同时操作也要更为简单，速度也相当快速，除了2天文库制作时间，整个上机测序可在2-3.5小时内完成，通量目前是10G左右，但非常适合小基因组和外显子验证的测序。是一种经济、快速、简单、规模可扩展的测序技术，非常适合扩增子测序的革命性技术。
（5）华大基因BGISEQ平台
自2013年华大基因收购Complete Genomics公司后，华大基因致力于开发基因测序平台，还喊出了“打造中国人自己的测序平台”的口号。2014年华大推出BGISEQ-1000、BGISEQ-100两款测序仪，这两款测序仪主要用于基因测序诊断领域，并于2018年1月被申请注销，测序平台已从原有的BGISEQ-100、BGISEQ-1000升级为BGISEQ-50、BGISEQ-500。BGISEQ-500及BGISEQ-50分别于2015、2016年推出，致力于拓展生育健康类测序业务。2017年华大又推出两款测序仪MGISEQ-200和MGISEQ-2000，这两款测序系统充分实现了低成本购机和低成本运行，其广泛的应用领域，包括科学研究、临床医学、农业、公安司法、环境工程等，实现了医疗和科研领域高通量测序系统的全面普及。
华大基因测序仪的与之前提到的4个测序平台有所区别， BGISEQ/MGISEQ系列测序仪采用先进的联合探针锚定聚合技术（cPAS）和改进的DNA纳米球（DNB）核心测序技术，将DNA分子锚与荧光探针在DNA纳米球上进行聚合，利用高分辨率成像系统对光信号进行采集，并通过对光信号的数字化处理，最终获得待测DNA序列信息。具体步骤如下：
1. DNA提取与片段化
准备样本 → DNA提取 → DNA片段化处理 → DNA片段末端修复
2. DNA片段扩增（纳米球技术DNB）
加接头序列 → 分离出单股DNA → 成环 → 滚环扩增 → 形成DNA纳米球（DNB）
基因组DNA首先经过片段化处理，末端修复后再加上接头序列，分离出单股DNA后并环化形成单链环状DNA。环装DNA在DNA聚合酶的作用下绕着DNA环不停地转圈，复制出的上百份拷贝都在一股新DNA上，就像一股毛线卷成了毛线团一样，最后形成一团DNA纳米球（DNB, DNA Nano Ball），这一步即为滚环扩增技术（Rolling circle amplification, RCA），可将单链环状DNA扩增2-3个数量级。
3. DNA序列识别
DNA纳米球附着芯片 → 组合探针锚定连接法测序
DNB纳米球经过装载技术固定在阵列化（Patterned Array）的硅芯片上，芯片每个位点的蛋白质上自动附着上去一个DNB纳米球并且不会发生堆叠。接下来就是测序过程了，华大测序仪采用了联合探针锚定聚合(combinatorial Probe Anchor Synthesis，cPAS)技术进行测序，首先DNA分子锚和荧光探针在DNB上进行聚合，随后高分辨率成像系统对光信号进行采集，光信号经过数字化处理后即可获得待测序列。
4. 分析
碱基读取 → 数据比对和组装 → 基因组 → 结果分析
5. 技术优势
与其他二代测序技术相比较，DNB测序技术具有以下几个优势：
（1）DNB通过增加待测DNA的拷贝数而增强了信号强度，从而提高测序准确度；
（2）不同于PCR指数扩增，滚环扩增技术的扩增错误不会累积；
（3）DNB与芯片上活化位点的大小相同，每个位点只固定一个DNB，保证信号点之间不产生相互干扰；
（4）阵列化测序芯片和DNB测序技术的结合，使得成像系统像素和测序芯片的面积得到最大化利用。
