RNA的甲醛变性电泳实验
RNA的甲醛变性电泳可以用于：（1）提取样品的总RNA后，一般根据RNA的凝胶电泳图来判断RNA的质量；（2）由于RNA容易形成二级结构，因此常用甲醛变性胶来进行RNA电泳，得到的电泳图能真实反映RNA的质量状况。
| 实验方法原理 | 用溴化乙锭等荧光染料示踪的核酸电泳结果可用于判定核酸的纯度。由于DNA分子较RNA分子大许多，电泳迁移率低；而RNA中以rRNA最多，占到80%~85%，tRNA及核内小分子RNA占15%~20%，mRNA占1%~5%。故总RNA电泳后可呈现特征性的三条带。在原核生物为明显可见的23S、16S的rRNA条带及由5S的rRNA及由5S、5.8S的rRNA和tRNA构成的条带。mRNA因量少且分子大小不一，一般是看不见的。故可通过分析以溴化乙锭为示踪染料的核酸凝胶电泳结果。
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| 实验材料 | |
| 试剂、试剂盒 | |
| 仪器、耗材 | |
| 实验步骤 | 一、材料、试剂和仪器 1. 材料：植物总RNA 5-10 ug 2. 试剂 （1）加样运载缓冲液（Loading buffer） 50% 甘油 1 mmol/L EDTA （pH8.0） 0.25%溴酚蓝 25%二甲苯氰FF （2）10xTAE Buffer （3）5x甲醛凝胶电泳缓冲液： 0.1 mol/L MOPs （pH7.0） 40 mmol/L乙酸钠 5 mmol/L DETA（pH8.0） （4）甲醛，甲酰胺 3. 仪器：电泳装置，紫外透射观测仪 二、实验程序 1. 甲醛变性的琼脂糖（Agarose） 凝胶的配制 在250 mL的锥形瓶中准确称量2 g Agarose （Sigama），再加20 mL 10xTAE Buffer，144 mLDEPC处理过的双蒸水，微波炉中化胶，待冷却至50-60℃加EB至终浓度≤0.5 ug/mL。在通风橱中加入36 mL甲醛，放置一段时间以减少甲醛蒸汽。 2. RNA的甲醛变性电泳 （1） 样品制备 RNA总量：10 ug 5×甲醛凝胶电泳缓冲液：4 ul 甲醛： 3.5 ul 甲酰胺：10 ul 加入无菌离心管中混合，95℃水浴变性2 min（或55℃，15 min），取出后放入冰中冷却。 （2） 加入2 ul无菌的DEPC处理的加样运载液。（使用加样运载液的目的有三： 增大样品密度，以确保DNA均匀进入样品孔内；使样品呈现颜色，便于加样操作；能明确显现样品在电泳胶上的泳动位置。以 0.5 X TBE作电泳液时，溴苯酚在琼脂糖中的泳动速率与长 300 bp 的双链线状DNA相同，而二甲苯氰FF 的泳动速率与长4 kb 的双链线状DNA相同。） （3）将胶板浸没在1x甲醛凝胶电泳缓冲液中，点样前5 V/cm预跑5 min。点样后3-4 V/cm电泳。 （4）电泳结束后（溴苯酚蓝迁移到约8 cm处），紫外灯下观察， 照相。 收起 |
| 注意事项 | 每一泳道至多可分析30mg RNA，通常用10-20mg总RNA进行Northern杂交，可以检测高丰度mRNA（占mRNA总量的0.1%以上）；如待测RNA含量极微，每个泳道加0.5-3.0mg poly(A) RNA。 |
| 其他 | 每一泳道至多可分析30mg RNA，通常用10-20mg总RNA进行Northern杂交，可以检测高丰度mRNA（占mRNA总量的0.1%以上）；如待测RNA含量极微，每个泳道加0.5-3.0mg poly(A) RNA。 |
