关注公众号

关注公众号

手机扫码查看

手机查看

喜欢作者

打赏方式

微信支付微信支付
支付宝支付支付宝支付
×

Western印迹法检测蛋白

2019.4.18

实验概要

Western印迹法检测蛋白的敏感性约为1-5ng,0.75mm厚的SDS-PAGE板的一个孔可上总蛋白量约为100μg,所以只要被检蛋白不低于总蛋白量的万分之一,即可被检测出来。如果所分析的样品为未知时,应同时作阳性对照。杂交技术主要有NC膜的封闭,靶蛋白与第一抗体的反应,结合靶蛋白的一抗与二抗的反应,显色等几部分构成。

实验原理

该技术的原理及过程主要为转移到NC等膜上的蛋白带。用其它蛋白作为封闭液,将膜上余下的其它蛋白可结合点封闭。加入与待检测目标靶蛋白有特异性的第一抗体,经免疫反应,一抗将与目标蛋白结合,再经用洗膜液洗涤后,膜上仅在靶蛋白上结合有第一抗体。再加入与第一抗体有免疫特异性的二抗,使之与一抗反应,反应后,经洗膜液洗涤,二抗就仅存在于结合靶蛋白的一抗上。因为这种二抗都为酶标抗体,所以通过酶标反应,在显色液中,膜上结合靶蛋白-一抗-二抗的位置即将呈现一定的颜色。

主要试剂

封闭液(TBST,3%BSA)

漂洗液 TBST(10mMTris-HCL,pH8.0,0.15mMNaCL,0.05%Tween-20),PBS(0.8%NaCl,0.02%KCl,0.144%Na2HPO4 0.024%KH2PO4 pH至7.4)

辣根过氧化物酶显色液(可用Ⅰ或II)

Ⅰ 取6mg diaminobenzidine tetrahydrochloride 溶于9ml  100mM Tris-HCl(pH7.6)中,加入1ml 0.3%(w/v)的NiCl2或CoCl2。过虑去除沉淀。取10ul  30%双氧水与上液充分混匀

注意,此液必须新鲜配制。

II  取20mg,4-chlor-1-raphthol于20ml冷甲醇中,另取60μl30%双氧水,混匀。

注意,此液必须新鲜配制。

碱性磷酸酶显色液

    5%NBT溶液 (溶于70%二甲基甲酰胺中)  66ul

    5%BCIP溶液(溶于100%二甲基甲酰胺中)  33ul

碱性磷酸酶缓冲液 100mMNaCl  5mMMgCl2  100mMTris-HCl(pH 9.5)

以上三者充分混匀,需要在30分钟内使用完。

主要设备

塑料封口机  摇床

实验步骤

1. NC膜漂洗,NC膜用TBST缓冲液漂洗一次

2. NC膜的封闭

NC膜与蛋白质的结合无任何特异性,因此作为特异性检测靶蛋白的探针-一抗蛋白也能与NC膜结合,而一旦这种结合情况发生,当加入二抗后,背景上将出现许多非特异性条带,而则势必造成目标蛋白的不可检测性。因此Western印迹技术的敏感性、可行性将取决于能否对NC膜上一些蛋白质潜在结合位点进行有效封闭。在实际操作中这些结合位点一般用脱脂奶粉封闭,也可用血清白蛋白封闭。如果操作中加蛋白封闭后,非特异性背景仍很大的话,则可在封闭液中加入Tween20,Tween20的存在,能降低背景噪声,且不影响抗体与靶抗原的结合。

将A中经电转移并干燥的NC膜放于一平皿中,加入封闭液(液面需盖过胶面)室温下轻轻遥荡2-3小时。

2. 目标靶蛋白与第一抗体的反应  

一抗的稀释:将第一抗体用封闭液稀释,稀释度由预实验确定,但可参考下列数据:多克隆抗体,1:100-1:5000  培养的杂交瘤细胞上清液,1:100  鼠腹水细胞1:1000-1:10000

3. 将B中封闭好的NC膜,放入塑料袋中,加入一抗,加入量为0.1ml一抗/cm2

NC膜,赶尽塑料袋内所有气泡,封口机封口,4℃下轻轻震荡2小时。

注意,在室温下,延长反应时间,可增加靶蛋白的可检出量,但也会增加非特异性结合,加大背景噪声。

4. 洗膜。反应完毕后,将塑料袋剪开,弃去反应液,用PBS洗三次,每次10分钟。

5. 靶蛋白-一抗复合物与二抗反应

   1) 将膜从PBS溶液中转至TBST溶液中,室温下轻轻震荡10分钟。

此操作是为了去除NC膜上的磷酸及叠氮钠

   2) 将二抗用二抗稀释液稀释,稀释度一般为1:200-1:2000。

   3) 将膜放入一塑料袋中,加入二抗溶液,加入量一般为0,1ml二抗溶液/cm2膜,封好塑料袋,在室温下轻轻震荡1小时。

6. 剪开塑料袋,取出NC膜,在TBST溶液中冲洗1-5次,每次10分钟。

7. 显色 

   1) AP系统

      a. 将膜放入碱性磷酸酶显色液(10ml碱性磷酸酶缓冲液,66ulNBT,33ulBCIP)中,室温下轻轻摇动。

      b. 待条带出现后(约显色20分钟),将膜放入200ul0.5MEDTA(pH8.0)和50mlPBS溶液中

      c. 照相

   2) 辣根过氧化物酶系统

      a. 将膜放入显色液中,室温下轻轻摇动。

      b. 待条带出现后(约显色1-3分钟),立刻用水洗膜,然后转入PBS中

注意,此显色带在阳光下几小时即褪色

      c. 照相


推荐
热点排行
一周推荐
关闭