原代细胞的培养与建系-2
(二)原代细胞的维持
1、贴壁细胞（包括半贴壁细胞的换液）
贴壁细胞长成网状或基本单层时，由于营养缺乏，代谢产物增多，pH变酸，不适宜细胞生长，此时细胞还未长成单层，未达到饱和密度，仍需继续培养，因此，需采取换液方式来更新营养成分以满足细胞继续生长繁殖的需要。其换液方法比较简单，即弃去旧液，加入与原培养液相同的等量完全培养基。若希望细胞能在较长时间内能维持存活，但不需增殖，此时要换成含2%小牛血清的维持液。
2、悬浮细胞
凡经培养后只在细胞培养基中悬浮生长而不贴壁的细胞，需在倒置显微镜下方可观察到细胞的形态和生长现象，淋巴细胞的短期培养无需换液，但加入生长因子或有丝分裂源（PHA、PMA、COnA、PWM、LPS等）后，细胞不仅会发生转化而且会发生分裂繁殖，此时培养基中的营养成分并不能维持细胞的营养需求，加之代谢产物增多，pH变酸，细胞不适宜生长，需进行换液。白血病细胞或淋巴瘤细胞体外长期培养时，都需换液培养，待达到饱和密度时才能传代。换液时，只能采用半量换液的方式，千万不能采取倒去旧液加入新液的方式进行换液。
半量换液的方法如下：
将原培养瓶竖起，在30分钟内，若细胞沉于瓶底，可用吸管轻轻吸去一半上清弃去，再加入等量的新鲜完全培养基。若细胞不能沉于瓶底，可吸出细胞悬液，采用低速离心（1000r/min 10min）弃去一半上清加入等量的新鲜完全培养基，混匀后再转入原瓶继续培养。
二、原代细胞培养的首次传代
原代培养后由于悬浮细胞增殖，数量增加甚至达饱和密度，贴壁细胞的相互汇合，使整个瓶底逐渐被细胞覆盖，细胞难以继续生长繁殖，需要进行分瓶培养，这种使原代细胞经分散接种的过程称之为传代。每进行一次分离再培养称之为传一代，传至5～10代以内的细胞通常称为次代培养细胞，传至10~20代以上的细胞，通常确定为传代细胞（或称传代细胞系）。然而，传代细胞系的建立，关键是初代培养的首次传代。
应注意如下几点：
(1)细胞生长密度不高时，或未能达到覆盖整个瓶底时不能急于传代。
(2)原代培养的贴壁细胞多为混杂细胞，形态各异，往往是上皮样细胞和成纤维样细胞并存，采用胰蛋白酶消化时要掌握好消化时间，因成纤维细胞易于脱壁，上皮细胞不易脱壁，因此，可根据需要选用适当的消化时间及时中止消化。在早先传代时，其消化时间比一般已建系的细胞相对长一些。
(3)吹打已消化的细胞要轻巧，既不能听到有明显的吹打声，又不能有大量泡沫在悬液中形成，以尽可能减少对细胞的机械损伤。
(4)首次传代时细胞接种数量要多一些，以利于细胞的生存和繁殖。如果消化分离的细胞悬液有组织块，也一并传入到培养瓶，尽量减少细胞损失。
(5)首次传代培养时的pH不能高，宁可偏低一些。此外，小牛血清浓度可适当加大至15%～20%左右。
三、传代细胞的传代培养
原代细胞经传代后所形成的传代细胞，可根据不同细胞采取不同的方法进行细胞传代。贴壁生长的细胞用消化法传代，部分贴壁的细胞用直接吹打或用硅胶软刮的刮除法传代。悬浮细胞可采用加入等量新鲜培养基后直接吹打分散进行传代，或用自然沉降法加入新培养基后再吹打分散进行传代。后两种传代方法比较简单，唯有贴壁细胞的消化传代法比较复杂一些。
现将具体方法介绍如下：
(1)吸除或倒掉原瓶中的旧培养基（以25mL培养瓶为例）。
(2)每瓶加入2mL，无钙、镁PBS，漂洗一次后倒掉。
(3)每瓶加入1mL消化液（0.25%胰蛋白酶或0.02鞹A或混合液），轻轻摇动培养瓶，经消化液铺满所有细胞表面，待细胞层略有松动，肉眼可观察到“薄膜”现象时，倒掉消化液，再继续作用2～3分钟，轻轻摇动，细胞层可随残留的消化液呈片状从瓶壁上脱落下来，在显微镜下可发现细胞回缩变圆，细胞间隙增大，此时应立即终止消化。
(4)加入完全培养基5mL，用吸管反复吹打瓶壁上的细胞，吹打时要按顺序进行，以确保所有瓶壁均吹打到，吹打时动作要轻柔，不要用力过大，尽可能不要出现泡沫，以避免细胞的机械损伤。
(5)用计数板计数，计算细胞的浓度，并用培养基调整适当的细胞浓度后再分瓶培养。
四、传代细胞的建系和维持
细胞系的维持是培养工作的重要内容，是通过换液传代再换液、再传代和细胞种子冻存来实现的，但对每一个细胞系来说都有其自身的特点，要做好建系的维持须注意以下几点：
1.细胞档案
细胞档案要记录好，如组织来源、生物学特性（由形态、生长繁殖曲线、染色体核型情况、代谢特性、分化特性、病毒敏感性、致瘤特性、有无支原体和潜存病毒等）、培养基的要求、传代换液时间、扩增时间(分裂指数)，细胞的特殊遗传标志(标记染色体)等，这些记录对于保证细胞的正常生长，保持细胞的一致和经长期培养细胞特性的变异比较，都有十分重要的意义。
2.换液传代
(1)细胞系的传代、换液方法与前相同，但一般都有自身的规律性，因而在继续传代时，要注意保持其稳定的规律性，这样可以减少由于传代时细胞密度的频繁增减或换液时间的不规律而导致细胞生长特性的改变，给以后的实验带来影响。
(2)多种细胞系维持传代，要严格操作程序，对所用的试剂各系不能交叉，甚至每个细胞系均需单独实验室，传代时各系均分开单独操作，每传5代后，细胞种子均应冻存。传代时均应作好记录，培养瓶上要有明显标记，标记细胞系名称和传代的代数及传代时间。若细胞生长较快，可减去换液程序，每次均可传代。每个传代细胞系，最好能分成2～3条线，分别传代，同时也可在适温或4℃短期存放一瓶，以防止污染丢失。细胞种子的及时冻存不仅可防止污染丢失，而且还可防止因盲目传代而造成细胞变异，此外还可提供不同代次的细胞同时进行对比试验。
3.细胞系（或株）的鉴定和管理
当一个细胞系（或株）建立后，专家鉴定可有可无，按国际惯例，只要认真研究，记录完整，资料和结果确切，就可在有关杂志上或刊物上报道细胞的各次实验指标。
