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TRIzol法同时提取RNA、DNA、蛋白质-3

2019.8.02

DNA污染:

A. 样品匀浆时加的试剂量太少。

B.样品中含有有机溶剂(如乙醇,DMSO等),强缓冲液或碱性溶液。

蛋白聚糖和多糖污染:

沉淀RNA的过程中作以下改进可去除这些污染,步骤7中,每使用1ml TRIzol在水相中加0.25ml异丙醇和0.25ml高盐溶液(0.8M柠檬酸钠和1.2MNaCl)混合离心,按之前操作进行。这种方法可使蛋白聚糖和多糖留在溶液中,高效沉淀出纯RNA。从含有大量多糖的植物中提取RNA时应在匀浆后离心,并加上以上操作步骤。

DNA的分离

准备试剂:乙醇0.1M柠檬酸钠(含10%乙醇) 75%乙醇8mM NaOH

操作步骤:

1. 样品加氯仿分层后,移去上层水相,用乙醇沉淀中间层和有机相中的DNA。每使用1mlTRIzol加0.3ml无水乙醇混匀,室温放置3分钟,2~8℃不超过2000×g离心5分钟。

2. 移去上清,(如需分离蛋白质,可保留,进一步操作见后)用含10%乙醇的0.1M柠檬酸钠洗涤DNA沉淀。每用1mlTRIzol加入1ml柠檬酸钠,室温放置30分钟,2~8℃2000×g离心5分钟,弃上清,重复一次。

3. 用75%乙醇再洗一遍DNA沉淀,每用1ml TRIzol加入1.5~2 ml75%乙醇,室温放置10~20分钟(不时颠倒混合)2~8℃2000×g离心5分钟, 弃上清。

4. 室温放置晾干DNA 5~15分钟,用8mM NaOH溶解DNA。从50~70mg组织或107细胞中分离的DNA溶于300~600μl 8mM NaOH,DNA的浓度通常为0.2~0.3μg/μl。提取的DNA沉淀不易溶于水和Tris缓冲液中,建议用弱碱溶解,8mMNaOH的pH值为9,溶解DNA后可用TE,HEPES调节pH。从某些样品(尤其是组织)中提取的DNA中可能包含一些胶状不溶物可>12000×g离心10分钟除去。

DNA的定量:取一份溶于8mMNaOH的DNA加水测A260值。一单位A260值相当于50μg/ml双链DNA。根据DNA产量可估计细胞数,人、大鼠、小鼠1×106二倍体细胞含DNA的量分别为7.1μg,6.5μg,5.8μg。

预期产量:1mg组织或1×106细胞提取DNA分别为肝和肾3~4μg 骨骼肌,脑组织,胎盘2~3μg 人,大鼠,小鼠培养细胞(1×106)5~7μg 成纤维细胞5~7μg。

应用:

1.用于PCR 溶于8mM NaOH的DNA用0.1M HEPES调pH至8.4,取0.1~1μg DNA用作模板。

2.酶切反应用HEPES或1mM EDTA调节pH至适当值。每μg DNA使用3~5单位的酶,80~90%的DNA是可消化的。

1ml 8mM NaOH溶解的DNA样品pH值调节

Final pH 0.1M HEPES(μl) Final pH 1M HEPES(μl)

8.4 86 7.2 23

8.2 93 7.0 32

8.0 101

7.8 117

7.5 159


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