转基因小鼠模型的建立(SOP)-7

10）  移卵操作完成后，撤回移卵管，去除器械，按原本位置将各器官重置于腹腔内。

10）缝合切口，用小夹夹持皮肤。常用自动小夹代替缝线，这样可以避免小鼠啃嘶缝线，切口裂开。

11）若进行双侧手术，则于另一侧子宫角重复上述操作。

12）手术完成后，安置小鼠于清洁的笼中。麻醉状态下，小型哺乳动物无法有效维持机体温度。所以应该注意小鼠的保温。可以用热垫保持其温度直到动物苏醒。所有的动物在回笼前20-30分可苏醒。由于妊娠很容易使受体母鼠产生应激反应导致流产或食子，所以对受体母鼠必须严格监护。

（2）注射后期监护：手术后严格监护防止并发症的发生非常重要。麻醉易诱导小鼠出现血压升高，所以手术后必须严密监护至少2小时，同时推荐进行保温处理。

处于麻醉状态的小鼠应该用软纱布包裹，而且笼中加垫草垫以及软材料，并保持鼠笼温度。正常体温的维持可以缩短动物处于麻醉状态的时间。

手术后小鼠常规4-5天观察一次以确保小鼠处于恢复中，清醒小鼠应活动自如。腹腔手术后小鼠有发生肠疝的可能。所以手术时保持切口尽量小，缝合严密，而组织胶水的正确应用可以避免此类并发症的发生。皮肤必须用缝线或不锈刚夹夹闭，手术后1-2周可拔除。如果动物状态不良，表现厌食，脱水，或明显弓背，通过动物饮水可给予羟苯基乙酰胺以及同类止疼药。若发生脱水，可腹腔注射0.9%生理盐水或林格氏液。若仍无改善可在麻醉状态下重新打开手切口确认是否有疝发生。若动物状态无明显好转，最终采用安乐死进行。

（四）转基因小鼠的鉴定

产出的鼠仔中，属转基因小鼠者，约占全部仔小鼠的20％-30％。因此，对转基因小鼠必须进行鉴定筛选。

1．  转基因整合检测

鉴定转基因小鼠最简单的方法是从小鼠尾尖提取基因组DNA，检测其基因型。检测方法包括PCR和Shouthern 杂交。

（1）  基因组DNA的提取：

1）  将离乳期小鼠（>4周龄）麻醉标记。

2）  用一只手抓住小鼠，另一只手持消毒剪剪下约1cm的鼠尾。

3）  将剪下的鼠尾放入500?l消化缓冲液中（50mmol/L Tris-HCl, pH8.0; 100mmol/LEDTA; 100mmol/LNaCl; 1%SDS）, 并加入蛋白酶K使其终浓度为100 ?g/ml，550C下震荡孵育3~4 小时或过夜孵育。

4）  加入5 ?l RNA酶A，370C孵育1~2小时。

5）  DNA的分离纯化步骤参见第一章的第三节。

（2）  PCR检测： 转基因的初始筛选通常采用PCR检测技术。该技术操作简便、快速、费用低而有效，适合大量标本的分析。由于该技术特别敏感，可能产生假阳性结果。因此，在操作过程中必须特别小心，避免质粒DNA或其它标本的基因组DNA的污染。假阳性的产生对转基因小鼠的筛选工作将是致命的。PCR实验应采用双复管，甚至三复管。阳性结果最好用Southern杂交技术进一步证实。

PCR的实验操作参见第一章的第六节。

（3）  Southern blot分析：该技术虽然没有PCR技术那样敏感，且费力费时，但是避免了因污染导致假阳性结果的麻烦，可以得到目的基因整合后的基因组、整合位点数目、转基因拷贝数等的确切信息。Southern blot的实验操作参见第一章的第八节。

2．  转基因表达检测

转基因整合检测是确定目的基因是否整合到了小鼠的基因组中，同时可确定整合的位点和拷贝数，这在遗传学上是十分重要的。而转基因表达检测是确定目的基因在转基因小鼠器官组织中表达的时空分布。其检测包括RNA分析技术和蛋白质检测技术。