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叶绿体DNA分离

2020.7.14

设备:Hitachi CS-150GXL或CS-120GXL微量超速离心机,S100AT6 转头,5PA 密封管(如果用4PC管,可接比例减少各层液量)
溶液配制:
A液:0.35Msorbitol(山梨醇),50mM Tris—Hcl (PH8.0) 25mM EDTA—Na2
B液:5%(w/w)Sodium N—lauroyl Sarcosinate  (N—月桂肌氨酸钠)
方法:CsCl 平衡等密度离心方法 (equilibrium isopycnic)
分离步骤:
1.5ml 叶绿体稀释加5ml A液
2.CF7D2 或同类离心机 2500rpm 4℃,15分钟,50ml ,PP管
3.(2)的沉淀加20—30ml  A液“洗”2—3次(用(2)参数离心2—3次)
4.(3)的沉淀加2ml A液及 pronase (链霉蛋白酶)
5.培养:37℃,2小时。取出后室温平衡2分钟
6.混合器混匀(15分钟)
7.再培养4℃,(2—3)小时
8.离心:2500rpm,4℃,15分钟,上清液为粗制DNA液
9.超速离心加样:5 ml 密封管,样品((8)的上清)3.61 ml 加入3.35g CsCl,E.B (ethidium bromide) (澳化乙锭) (10mg/ml):50ul。溶液CsCl密度为ρ=1.55g/cm3 ,混匀后密封(用日立STF2自动熔封器)
注:以上是单管配置,如配双管或多管,则所有步骤容量都增加倍数。
10.离心:日立CS—150GXL或CS—120GXL 离心机或同类机型S100AT6转头,5ml密封管。70,000rpm(约296,000xg,K=37),离心16小时,20℃,加速“9”,减速“7”。
注:由于对同一样品离心时间与K近似值成正比,使用其他型号转头可参照实际的K值决定离心时间
11.结果:在离心管中部可见明显的宽约2mm的叶绿体DNA条带,用讲座文章3a篇中的方法取出。

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