实验材料 玻璃及塑料器皿

试剂、试剂盒 溶液与缓冲液引物

仪器、耗材 试剂盒MPC-EPCR仪Gene PulserII 型系统

实验步骤

一、一般原则

若用于 SAGE 的 RNA 有足够的量，最好用 2.5~5 ug polyA+RNA, 可按实验方案 A 进行。这里我们还提供了实验方案 B，它在多个步骤上已做了修改，适用于仅有微量的原材料（例如，利用这个流程我们能从来自于 300fxm 脑切片的海马样品中获得基因表达谱)。后一实验方案尤适用研究神经组织表达，由于其复杂的神经环路及高度特化的结构，获得大量均质组织以分离 RNA 往往是不可能的。

下面对两组实验方案第 1 步到第 8 步进行了详细的描述，从第 9 步起两组方案步骤相同。

二、mRNA 的分离

实验方案 A

许多试剂盒分离 PdyA+RNA 的效果都很好，我们推荐使用 mRNADIRECT 试剂盒（Dynal;610.11) 来从组织中或培养的细胞中分离 polyA+RNA，或者用 mRNA 纯化试剂盒（Dynal;610.01) 从总 RNA 中分离 pdyA+RNA。在试剂盒说明书中对所有步骤有详细的描述。

实验方案 B

1.TRIzol 分离总 RNA(见 DD 实验方案)。

2.在 RNA 沉淀后，将 1~10 吨总 RNA 重悬于 20 ul 裂解缓冲液中（mRNA 捕获试剂盒)。

注意：我们用更少量的总 RNA 也可成功地提取 mRNA，但这要求在 SAGE 后面的步骤中进行一些修改。

3.稀释 20X 生物素化的 oligo(dT)20 引物（mRNA 捕获试剂盒）到最终浓度为 5Pmol/ul。

4.将 4 ul 稀释的引物加入到含有 RNA 的裂解缓冲液中。

5.在 37℃ 退火 5 min。

6.转移 RNA 到一个链霉抗生物素包被的 PCR 管中（mRNA 捕获试剂盒)。

7.在 37℃ 保温孵育 3 min(在此步中通过链球菌素-生物素结合 mRNA 被固定于试管壁上)。

8.移去管中溶液（含有未结合的 RNA 片段：rRNA、tRNA 等)，用 50 ul 洗液小心地冲洗试管 3 次（mRNA 捕获试剂盒)。

9.去除洗液。

10.立即进行 cDNA 合成步骤。

三、cDNA 合成

实验方案 A

1.以 oligo(dT)-引物加入 2.5~5 ug polyA+RNA 合成 cDNA。

2.在 0.5 mlPCR 管中混合（冰上操作）：

—2.5 ul polyA+RNA(1 ug/ul)

一 4 ul 5X 第一^缓冲液

—2 ul 0.lmol/LDTT

—1 ul 10 mmol/LdNTPs

一 1 ul oligo(dT)18(生物素化的）（0.5ug/ul)

一 1 ul SuperScriptHRT(200ug/ul)

—8.5 ul DEPC 水

总体积为 20 ul。

3.42℃ 孵育 2 h(可在 PCR 仪中进行)。

4.在冰上加单链 cDNA 进行第二链合成：

—(20 ul 单链 cDNA)

一 16 ul 5x 第二链缓冲液

—1.6 ul 10 mmol/LdNTPs

—2 ul DNA 多聚酶 I(10u/ul)

—1 ul T4DNA 连接酶（5u/ul）

—1 ul RNase H(5u/ul)

一 38.4 ul 重蒸（馏）水

总体积为 80 ul。

5.在 16℃ 孵育 2 h。

6.用 LoTE 扩容至 200ul。

7.加等体积的酚/氯仿/异戊醇（25:24:1)(PCI)。

8.振荡。

9.在 4°C 微量离心机中以 13OOOr/min 离心 5 min。

10.转移上层水相至一新 1.5 ml Eppendorf 试管中。

11.乙醇沉淀：

—3 ul 糖原

一 100 ul 10 mmol/L 乙酸铵

一 700 ul 乙醇

12.置于-20°C 下 30 min。

13.在 4”C，在微量离心机中以 13OOOr/min 离心 15 min。

14.以 500 ul 70% 乙醇有力振荡冲洗沉淀两遍。

15.去除 70% 乙醇，让沉淀物在空气中风干约 15 min。

16.将沉淀重新悬浮于 20 ul LoTE 中。

实验方案 B

注意：用来捕获 PolyA+RNA 并将其固定到试管壁上（实验方案 B，第 1 步）的 oligo(dT)2a 引物（生物素化，mRNA 捕获试剂盒)，可直接作为 cDNA 合成的引物，cDNA 合成后持续结合于试管壁上，直到第六步通过 TE 消化释放。

1.用 50 ul 1 第一链缓冲液冲洗捕获 PolyA+RNA 的试管，然后移去缓冲液。

2.用下述步骤代替 IX 第一链缓冲液（在冰上移液)：

—4 ul 的 5X 第一链缓冲液

一 2 ul 的 0.1mol/L TT

一 I ul 的 10 mmol/LdNTPs

一 1 ul 的 SuperScriptII RT (200 U/ul)

—12 ul DEPC 水

总体积为 20ul。

3.42℃ 下孵育 2 h（在 PCR 仪进行)。

4.从试管中移去反应混合物，并以 50 的 IX 第二链缓冲液洗涤试管 1 次 (mRNA 捕获试剂盒)。

5.移去冲洗液，用 5 〇 4 的 IX 第二链缓冲液洗涤试管 1 次。

6.用下述溶液替代 IX 第一链缓冲液

一 4 ul5X 第二链缓冲液

_0.4ul 的 IOmmol/LdNTPs

—Iul DNA 多聚酶 I (10 U/pl)

—0.5ulT4DNA 连接酶（5U/-)

—0.5ul RNaseH(5U//^l)

—13.6 ul 蒸馏水

总体积为 20ul。

7.在 16℃ 下孵育 2 h。

双链 cDNA 可保存于-20℃, 或者直接在下一步中应用（以锚定酶消化 cDNA)。