植物蛋白质组学中的双向电泳技术实验（一）

试剂、试剂盒 尿素裂解溶液IPG 干胶条水化液IPG 胶条平衡液SDS 凝胶缓冲液电极缓冲液储液丙烯酰胺 甲叉双丙烯酰胺溶液过硫酸铵溶液琼脂糖溶液

仪器、耗材 等电聚焦仪 IPGphor多重垂直 SDS 电泳仪

实验步骤

3.1 第一向：在 IPG 胶条中进行等电聚焦（ IPG-IEF)

采用 IPG ( IPG-Dalt ) 的双向电泳技术的第一向，等电聚焦（IEF) 是采用独立的，3 mm 宽的，附着在 GelBond  PAG 支持膜上的 IPG 胶条进行的。目前已有 7cm、11cm、18cm 和（或）24 cm 长的几乎所有需要的 pH 范围的预制 Immobiline 干胶条。例如，宽 pH 范围的 IPG 3~10 和 IPG 3~11，中等 pH 范围的 IPG 4~7 或 IPG 6~9 , 窄 pH 范围的 IPG 4~5 或 IPG 4.5~5.5 ( 如 GE  Healthcare，Bio- Rad，Sigma- Aldrich，Serva) 。或者也可使用实验室自制 IPG 干胶条。关于 IPG 灌制的细节，有兴趣的读者可以参考之前发表的方法 [21] 。

在进行 IEF 之前，需要水化 IPG 干胶条，然后再将胶条置于水平等电聚焦仪的冷却盘上 [13，22] 。最近，一种 叫做 IPGphor 的整体系统的使用简化并加速了 IPCMEF。这种仪器的特点有：在持胶槽中水化单独的 IPG 干胶条或在水化同时上样，可以选择杯上样，使用高电压（8000V ) 进行后续 IEF，在 IPG 干胶条放入陶瓷持胶槽后无需再对其进行操作。

当使用 pH 大于 9 的 IPG 胶条时，DTT 的消耗会导致碱性端的水平漂移。为消除漂移，在胶条的水化液中，可用二硫代羟乙基（HED)  (DeStreak，GE Healthcare ) 代替 DTT 等还原剂来保持半胱氨酸中二硫键的稳定。除了能去除漂移外，使用 HED 使点更清晰并提髙重复性 [23] 。而且，使 用 IPGphor，可使如核糖体和核蛋白等等电点大于 10 的极端碱性蛋白的等电聚焦得到大大的简化。

1. IPG 胶条的水化和上样

在进行 IEF 之前，IPG 干胶条必须在水化盒或水化盘中水化至其原始厚度 0.5 mm。IPG 干胶条可用溶解有样品的水化液进行水化（水化上样 ) [24] 或用不含样品的水化液进行水化，然后再用杯上样的方法上样。虽然水化上样更方便，但在样品含有高分子质量( < 100 kDa) ，极端碱性和（或）极端疏水的蛋白质时不推荐使用这种方法。这是因为这些蛋白质不易进入胶内。其原因可能是蛋白质和水化盘壁之间的疏水互作或凝胶基质孔径的限制作用。如果样品体积显著地超出 IPG 胶条水化后预计达到的体积，后一种现象就特别明显。高分子质量蛋白质更可能留在多出的水化液中而不是进入 IEF 胶中。交叉污染也是一个问题，因此水化盘在不同次实验之间必须彻底清洗。总之，水化上样不如杯上样可靠，特别是在定量实验中。

在杯上样中，IPG 干胶条仍旧用水化液水化。IPG 胶条水化后，将溶解在裂解缓冲液中的样品（20~100 μl ) 加 入在 IPG 胶条表面上的一次性塑料或硅胶杯中（见注释 3)。将样品加在 pH 极端位置时效果最好，也就是靠近阴极或阳极。大多数情况下在阳极附近上样比在阴极附近上样更好。当使用碱性 pH 梯度，如 IPG 6~12 或 9~12，所有样品都必须从阳极上样 [15~17] 。

单根 IPG 胶条的蛋白质上样量由几个因素决定。按照经验：分离距离越长（也就是胶条越长），pH 梯度范围越窄，蛋白质检测方法越不灵敏，则所需蛋白质越多。20 cm X 20 cm 的分析用（银染）双向电泳凝胶的推荐上样量为 50~100 μg，微量制备凝胶的推荐上样量多至 1 mg ( 或更多）。当使用非常窄的 pH 范围的 IPG 胶条时，我们强烈建议仅使用预分离后的样品 [ 25 ] 。

1 ) 用水化盘水化 IPG 干胶条

( 1 ) 如果在水化的同时上样 [24]，则直接将细胞裂解产物或组织样品（5~10 mg 蛋白质/ml ) 溶解至适量的 IPG 干胶条水化液中。水化 180 mm 长、3 mm 宽的胶条时，可吸取 350 μl 上述溶液置于 IPG 干胶条水化盘中的凹槽中（图 13-2)。如 IPG 胶条更长或更短，水化液体积需要进行相应换算（如 240 mm 长的 IPG 干胶条用 450 μl) 。

( 2 ) 从 IPG 干胶条表面撕去保护膜，将 IPG 胶条胶面朝下放入凹槽中，同时避免产生气泡。然后用 IPG 干胶条覆盖油覆盖 IPG 胶条（避免水化时胶条变干）。覆盖前胶条应能够活动且没有粘在水化盘上。覆盖后在约 20°C 条件下过夜水化 IPG 胶条。温度过高（ > 37°C ) 有氨基甲酰化的危险，而温度过低（< 15°C ) 会导致尿素在 IPG 胶中结晶。

( 3 ) 如果使用杯上样，则将 IPG 干胶条用没有样品的水化液在水化盘中仍旧按上述第二步的方法过夜水化。

2 ) 用 IPGphor 持胶槽水化胶条并同时上样

( 1 ) 用样品溶解缓冲液（也就是尿素/硫脲裂解缓冲液）溶解蛋白质并用 IPG 干胶条水化缓冲液稀释提取液。

( 2 ) 将所需数量的 IPGphor 持胶槽（图 13-2) 置于 IPGphor 的冷却盘/电极区域。

( 3 ) 吸取 350 μl 溶有样品的水化液（使用 180 mm 长 的 IPG 胶条时）放入持胶槽底部。

( 4 ) 由 IPG 胶条上去除保护膜，然后缓慢地将 IPG 胶条（胶面朝下）放入水化液中。避免产生气泡。胶条应仍然能够活动且没有粘在水化盘上。用 1~2 ml IPG 干胶条覆盖油覆盖 IPG 胶条然后盖上塑料盖。按压在盖子下的支撑块以确保 IPG 胶条在水化时与电极保持良好接触。水化时加低电压（30~50 V ) 以使高分子质量蛋白质更好地进入胶内 [15，28] 。