每年三月初，都是科研界的“高考”倒计时，因为距离国自然基金申请的截止日期已不到半月。纵观历年国自然申请情况，蛋白的翻译后修饰都是申请中重大研究方向之一。2018年国自然统计表明，磷酸化、泛素化、乙酰化等修饰的相关基金项目，总研究资助金额超过2亿。

　　继上周的肠道微生物研究方案解析后（国自然冲刺：打通菌群多样性与功能的研究策略），本周我们再抓紧时间为各位老师分享一下国自然中各类修饰的趋势分析及组学研究的注意事项，以期为各位老师提供帮助。下面我们主要关注三种最常规研究的修饰类型——磷酸化修饰、泛素化修饰和乙酰化修饰。

　　表现稳定：磷酸化——全能调控之王

　　磷酸化是修饰中的全能调控之王，其研究最早，且分布广，修饰量最多。在真核细胞中，约1/3的蛋白随时都可以被磷酸化，几乎参与所有的生理、病理过程。因此，磷酸化修饰是所有修饰中最被广泛认知和重点研究的。

　　▲ 磷酸化修饰在历年国自然基金中的申请情况

　　综上这些特点，在国自然基金申请中，与磷酸化、激酶相关的研究历年所获的资助项目数目均较多、且金额较高。然而，其成熟的研究基础也使得其每年的基金资助趋势稳定平缓。2018年的基金统计结果表明，与磷酸化相关的项目数有105个，资助金额4768万，而与激酶相关的项目数140个，资助金额高达6414.9万，其中重点项目有2个。因此，磷酸化可以说是修饰的基金申请中一个表现非常稳定的方向。

　　图1.国自然基金项目统计-磷酸化

　　▲ 磷酸化修饰组学研究方案的技术注意点：

　　● 磷酸化修饰肽段富集方法如何选择？

　　由于发生磷酸化修饰的氨基酸有三种--丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸，故根据研究目的的不同，磷酸化修饰肽段的富集方法也不同。目前，比较成熟的磷酸化富集方法主要有：金属螯合物富集（如TiO2、IMAC富集）和抗体富集两类。

　　对于三种氨基酸位点上的修饰均关注的老师来说，金属螯合物富集是最常用的富集介质。其富集效率较高，通常可以达到90%以上，其中一些商品化的IMAC试剂盒具备很理想的富集稳定性。

　　而对于重点关注酪氨酸磷酸化修饰变化的老师来说（比如说不少关注肿瘤领域中受体酪氨酸激酶研究的方向），使用TiO2、IMAC则无法满足要求了，这是由于酪氨酸磷酸化的修饰比例非常低，仅占所有蛋白质磷酸化比例的1%。因此，针对这类分析，往往采用酪氨酸特异性基序的抗体进行富集，才能获得最佳结果（中科新生命（APT）采用抗体界的金标准--CST的抗体进行酪氨酸磷酸化的富集）。

　　● 对于后续结果验证或者靶向检测的研究目的，如果没有修饰位点的抗体该怎么办？

　　基于质谱的PRM技术是修饰组后续验证或目标位点靶向检测的最佳选择之一。PRM验证全称是Parallel Reaction Monitoring,其是基于高分辨率质谱发展的靶向定量技术。由于其只针对特定目标信号进行扫描，可实现目标蛋白、修饰位点的精准定量，其应用目的类似于Western blot。

　　PRM已逐渐被业内广泛认可和关注，Nature、PNAS等高水平研究中已有多篇研究应用。此外，PRM可同时对多个蛋白、修饰位点进行定量，相比传统的WB,不仅更准确、精细而且更高效。目前，中科新生命已推出磷酸化修饰组+PRM验证一站式服务，帮助老师快速解决验证之忧。

　　● 磷酸化修饰组对样本量的要求如何？

　　势头正猛：泛素化——蛋白表达调控研究的新角度

　　泛素化是所有修饰中最为特别的一类修饰，由于发生泛素化修饰的蛋白往往会进一步通过蛋白酶体发生降解（也有一部分会发挥脚手架的作用促进蛋白复合体形成等），因此，蛋白表达水平变化往往是泛素化修饰的重要关注点。泛素化修饰与转录、蛋白水平研究同样重要的，都是调控蛋白表达水平的重要机制之一，但却往往被研究人员所忽略，其具备相对较高的研究创新性。

　　▲ 泛素化修饰在历年国自然基金中的申请情况

　　从历年的基金申请情况看，泛素化修饰所申请项目数与金额自2013年后每年均呈现快速增长趋势，而且2017年-2018年的增长速度为历年最快。统计结果表明，2018年泛素化研究的资助项目达137个，资助金额共6680.45万，其中重点项目有5个。

　　由此可见，泛素化相关基金无论是申请项目数还是金额数均在向磷酸化逼近，甚至从重点项目数看，18年泛素化的项目数已然超过了磷酸化。进一步统计表明，泛素化研究资助项目在医学部中一共98项，总资助金额高达4700万元。由此可见，泛素化的相关研究正是科研界的“当红小生”，基金申请的一大热点。

　　图2.国自然基金项目统计-泛素化

　　除基金之外，近几年，泛素化更是频频出现在各大CNS顶级杂志上，成为CNS杂志综述讨论的热点话题，从各种生理过程、到肿瘤、衰老等疾病、再到药物开发。可见，其在医学领域的重要作用、巨大潜力越来越得到重视，并有望成为继磷酸化之后的第二大明星修饰类型。

　　▲ 泛素化修饰组研究方案的技术注意点：

　　● 泛素化修饰肽段富集的选择？

　　目前，泛素化修饰肽段的富集还是采用基于赖氨素修饰基序抗体（K-GG）进行富集（同样，中科新生命是采用来自CST公司的抗体进行富集）。

　　● 泛素化修饰组的结果如何解读？后续验证有什么注意点？

　　由于泛素化修饰的蛋白很可能涉及后续的蛋白降解，因此各位老师在拿到泛素化组的数据时，如果发现结果中呈现出泛素化修饰的表达减少，不要认为一定是泛素化修饰水平降低了！其既有可能是修饰水平降低了也有可能是修饰水平增加了，这是泛素化修饰与其他修饰的结果解读非常不同的地方。因为泛素化修饰增加可直接导致蛋白降解，所以蛋白若是发生了泛素-蛋白酶体降解，其修饰量也是随着蛋白降解而降低的。因此，对于进行细胞水平研究的老师而言，我们建议需要用MG132预先处理细胞，抑制泛素酶体的降解过程。对于泛素化修饰的后续验证，不仅要验证修饰水平的变化，还要再进行蛋白水平的验证分析。

　　● 泛素化修饰组对样本量的要求如何？

　　推荐：常规动物组织样本120mg-2g；常规植物组织样本500mg-2g；细胞样本1-5×10^8个细胞

　　另辟蹊径：乙酰化修饰----代谢表现背后的调控机制

　　相对于磷酸化、泛素化而言，乙酰化研究更对关注于其对组蛋白的表观调控，而非组蛋白上的乙酰化修饰则相对较少。尤其是乙酰化对代谢过程的广泛调控作用，更是近些年才被认知的开创性发现。

　　▲ 乙酰化修饰在历年国自然基金中的申请情况

　　从历年的基金申请情况看，乙酰化修饰表现丝毫不落后，其相关研究所申请到的项目数、金额均呈现逐年增加的趋势，而且，在近两年（2016年-2018年）的增加速度最快。2018年，乙酰化研究的资助项目有111个，资助金额共5426万，重点项目2个。其中，医学部的乙酰化研究资助项目占48项，共3800万元资助。

　　图3.国自然基金项目统计-乙酰化

　　实际上，乙酰化的研究已有50年，除了发生于组蛋白，还有有大量的乙酰化修饰蛋白存在于细胞浆、线粒体等中，其对于信号转导、自噬等生物功能有广泛的调控作用。2009年，SCIENCE同时发表两篇研究，把乙酰化研究带入到一个新高度。其中一篇SCIENCE报道，在肝脏中发现了超过1000个乙酰化蛋白质，且代谢酶上普遍发生这样的修饰，至此，乙酰化调控代谢成为了编入教科书级的发现，代谢表型背后的调控机制--乙酰化，成为了代谢调控研究的新领域。这几年的nature reviews上，也是频频刊登“乙酰化调控代谢”的热点综述。

　　从组学的研究来看，乙酰化调控代谢是从一个非常具有新颖性的切入角度，这个角度使得对乙酰化功能的探索不仅仅局限于组蛋白上。因此，修饰组配合代谢组进行研究，是打通机制与表型的研究策略，是一个更为完整、创新的国自然基金研究方案。

　　▲ 乙酰化修饰组研究方案的技术注意点：

　　● 乙酰化修饰肽段富集如何选择？对样本量要求如何？

　　乙酰化修饰肽段富集主要采用赖氨酸乙酰化基序抗体进行富集（同样，中科新生命使用CST公司的修饰抗体）。

　　● 若要进行乙酰化组+代谢组的联合分析，对样本有何要求？

　　对于联合而言，保证两个组学样本间的一致性是关键。因此，乙酰化与代谢联合，我们推荐两个组学的样本来源均一致。如果有老师想要进一步利用相关性分析进行深入数据挖掘，两个组学之间的样本重复数目也要保持一致。

　　● 乙酰化修饰组对样本量的要求如何？

　　推荐：常规动物组织样本120mg-2g；常规植物组织样本500mg-2g；细胞样本1-5×10^8个细胞

　　总 结

　　纵观历年国自然申请情况，修饰都是申请中重大研究方向之一。到2018年国自然，磷酸化、泛素化、乙酰化，每一类修饰类型的项目资助金额均超过5000万，修饰方向的总研究资助金额超2亿。

　　如今，随着研究技术的发展，质谱作为研究翻译后修饰的最重要技术之一，越来越被广泛的应用于修饰的研究之中，也越来越能够与传统的分子生物学契合，助力高层次的研究。

　　图4.修饰组与传统生物技术结合的完整研究思路

　　如果各位老师需要详细的修饰组技术方法、资料，欢迎咨询我们。