基因表达轮廓（gene expressed profile）技术-2
经过这轮ＲＤＡ过程,Tester中的目的DNA将得到第一次富集。将第一轮产物更换新接头,进行第二轮RDA过程,目的DNA可得到进一步的富集。该技术假阳性很低。但仍不能解决个体mRNA在丰度上存在巨大差异的问题,当靶序列浓度较低时,其富集受抑制。
3：抑制消减杂交（suppression subtractive hybridization,SSH）技术
是Diatchenko于1996年建立的另一种应用PCR方法的消减杂交技术.该技术是反转合成testercDNA和drivercDNA,
RsaⅠ或HaeⅢ酶切成为短片段T和D,将T分为两份加不同的接头1（A1）和2(A2)(均为44/10
bp5’脱磷双链，5’脱P可保证只有接头中的长链可以与cDNA的5’-末端连接，分别具有一段反向末端重复序列，具体序列见实验),将T1和T2分别与过量的D杂交,第一轮杂交后,两组杂交产物混合,将这些产物再与D进行第二轮杂交,产生如下杂交体：T1/T2;T1/T1;T2/T2;T1/D;T2/D;D/D。杂交产物补平后作为模板,用A1和A2作为引物进行PCR扩增。在上述杂交体中T1/T2双链两端带有不同接头序列，因此可以指数扩增；T1/D和T2/D因只有一个引物配对序列所以只能线形扩增，而T1/T1和T2/T2尽管双链两端均带有接头，但由于其双链带的接头为同类，在末端补平后形成长反向重复序列，并且链内退火优于链间退火，因此在退火时产生“锅柄样”结构，无法与引物配对，不能扩增（此即为抑制PCR）；而D/D因没有引物配对序列则无法扩增，因此经过两次杂交及PCR后只有T1/T2复合体才能得到扩增。这样仅在目标样品中表达而在驱动样品中不表达的基因转录产物被差显。
SSH与cDNA-RDA相比除具有假阳性低，稳定性好的共性外，还解决了mRNA丰度差异的问题。SSH均衡了不同mRNA的丰度。对于丰度高的mRNA,经第二次杂交后很多将形成T1/T1或T2/T2杂交体，其形成T1/T2杂交体的频率与低丰度的mRNA形成的T1/T2杂交体差异不大。但SSH要求mRNA量过高，杂交时间过长，这些是该技术的缺陷。
4：基因表达系列分析（serial analysis of gene expression,SAGE ）
是Velculescu等于1995年建立了一种快速而高效地分析组织或细胞基因表达状态的方法。SAGE技术不仅能够全面地分析特定组织或细胞表达的基因并得到这些基因表达丰度的数量信息,而且还可比较不同细胞、组织、器官基因表达差异；不同发育阶段、不同时空、不同条件下基因表达差异；及非遗传多型性形成中基因表达的差异。SAGE是一种以序列分析为基础的分析基因表达差异的方法，其原理包括两个方面:(1)一个很短的核苷酸序列标签(9－11bp)就包含了足以区别单一转录本的信息。例如9个bp的序列即可区别262144(49)个转录本。(2)通过将短的序列标签链接起来即可以在一个克隆中对多个标签进行连续的测序分析。其实验路线主要包括:(1)以生物素化的poly(T)为引物反转录合成cDNA,
限制性内切酶（anchoring enzyme,AE,,锚定酶，专一性作用4碱基
CATG）切割cDNA，释放5′序列，链酶抗生物素蛋白磁珠吸附cDNA的3’端部分。(2)将cDNA分成两份,连接含有Ⅱ类限制性内切酶(标签酶,Tagging
enzyme,TE如BsmFI)酶切位点的接头序列A、B。Ⅱ类限制性内切酶。(3)用标签酶消化(TE在距识别位点20bp处切割DNA双链,
释放带有接头的SAGE标签（接有接头的cDNA片段）,(4)带有接头的SAGE标签经Klenow等DNA聚合酶补平后,
2个cDNA池的片段混合连接，形成带有两个接头的双标签(ditag),用引物A、B进行PCR扩增。(5)锚定酶切割去除引物A、B,得到位于两个锚定酶酶切位点之间的双标签序列,利用其两端的粘性末端,双标签序列之间互相链接,
形成长短不一的多联体，电泳分离后收集大小适中的片段克隆到载体中，测序，SAGE软件分析得到标签序列，以确定转录本的出现与否以及出现频率并登录GenBank、dbEST、SAGEmap数据库，进行比较，获取相关信息。
5:表达序列标签(expressed sequence tag ,EST)
是Venter.J.Cadams及Adams等于1991年提出。EST是从cDNA文库中随机挑取的cDNA克隆的外源插入片段的一端或两端进行一次性测序(Single-runsequencing)产生的DNA序列。每一个EST代表一个表达基因的部分转录片段,能说明该组织中各基因的表达水平。EST在数据库中其长度一般从20到7000ｂｐ不等,平均长度为60±120ｂｐ。EST的总体步骤为总mRNA提取，cDNA文库构建，随机挑取cDNA克隆，测序，数据库比对，电子杂交和电子延伸。EST目前主要用于构建基因图谱、充当探针、进行定位克隆并寻找新的基因、作为一种新的分子标记或新的SSR标记来源、用于研究生物群体多态性、进行功能基因的研究、进行基因表达信息及表达差异分析。
EST研究中所需的数据库主要为 National Center of Biotechnology Information,NCBI GenBank (http://www.nchi.nlm.nih.gov/web/GenBank/imdex. Html)； European Molecular Biology Laboratory European Bioinformatics Institute,EMBL-EBI (http://www.ebi.ac.uk/databases/index.html)；DNA Data Bank of Japan,DDBJ (http://www.ddbj.nig.ac.jp/)我国生物信息中心CBI(http://www.chi.pku.edu.cn)；美国Brookhaven国家实验室蛋白质结构数据库(PDB)；适于核酸序列查询的BLASTN、BLASTX、TBLASTX(主要用于EST分析)和适于蛋白质序列查询的BLASTN、BLASTP数据库;及DBEST(DatabaseEST,集成了Genbank、EMBL-EBI、DDBJ、PDB的非冗余的EST数据库);Nr(集成瑞士蛋白质数据库(SWISS-PROT)、蛋白质信息资源数据库(PIR)、日本蛋白质研究基金会蛋白质数据库(PRF)以及从Genbank序列编码区中的蛋白质和PDB中拥有原子座标的蛋白质的非冗余蛋白质数据库,
是一个非冗余DNA数据库)。
