LAK/TIL细胞的制备与活性测定
淋巴因子激活的细胞毒性细胞（lymphokine activated killer，LAK)和肿瘤浸润性淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocyte，TIL)在机体的免疫防御中起着十分重要的作用，特别是在肿瘤免疫过继疗法中具有重要的应用前景，其制备及活性的检测对于评价机体的免疫状态具有重要的意义。以下主要介绍LAK/TIL制备的常规方法。
(一)主要试剂材料
1.试剂①IL-2；②RPMI-1640；③ Ⅰ、Ⅳ型胶原酶，DNA酶；④四甲基偶氮盐；⑤酸化异丙醇：含0.04mo1/L HC1的异丙醇；⑥96孔细胞培养板。
易生物试剂库：
2.肿瘤细胞系Raji细胞、Daudi细胞为B细胞性白血病细胞株；Molt-4为T细胞性白血病细胞，对LAK细胞敏感，而对NK细胞毒作用不敏感；K562为红白血病细胞株，对NK细胞毒作用敏感。所有细胞株均培养在含10%~20%
NCS的RPMI-1640完全培养液中，取对数生长期细胞经不完全培养液洗涤，台盼蓝染色计数，以含20%
NCS的RPMI-1640培养液调整细胞浓度至2×106/ml备用。
(二)外周血单个核细胞( PBMC )的制备及其LAK细胞的诱导
(1)肝素抗凝健康人静脉血通过Ficoll-泛影葡胺密度梯度离心法分离PBMC，用含20% NCS的RPMI-1640完全培养液调整细胞浓度至1×106/ml。
(2)将上述细胞加人24孔培养板孔中，同时加人60ug PHA ，rhIL-2，终浓度为500U/ml，将细胞置37℃，5 %
CO2条件下培养，2~3d换液一次。吸弃1/2上清，加入含100U/ml的重组人IIr2 20%
NCS-RPMI-1640培养液，继续培养3d，收集细胞，即为LAK。
(三)脾细胞的制备及其LAK细胞的体外诱导
将通过灌注去除红细胞后的正常人外伤摘除的脾脏，按常规方法制备成单个脾细胞悬液，经离心洗涤后，用含20 %
NCS的RPMI-1640完全培养液调整细胞浓度至1×106/ml，加人rhIL-2，终浓度为500U/ml，将细胞置37℃，5%CO2条件下培养，2~3d换液一次。
(四)TIL细胞的分离制备及其诱导
(1)无菌切取肿瘤组织，置于含抗生素的RPMI-1640培养液中。
(2)将瘤体机械法剪碎，用RPMI-1640调整体积为10~ 20m1，同时加人0.05%的Ⅰ、Ⅳ型胶原酶、0.001%的透明质酸酶和DNA酶，室温搅拌4~6h。
(3)依次用80目和200目不锈钢网过滤。
(4)经过滤后的细胞悬液以无血清的RPMI-1640洗2次，1 500r/min离心5~l0min。
(5)用含5 % NCS的RPMI-1640完全培养液重悬细胞，将5ml比重为1.077的100%淋巴细胞分层液加人试管底层，其上缓慢加人75%的淋巴细胞分层液(用RPMI-1640配制)，然后缓慢加人上述肿瘤细胞悬液3~5ml。
(6)经1500~1800 r/min离心20min后，分别收集75%和100%淋巴细胞分层液界面层的TIL细胞和其上层的瘤细胞。
(7)用RPMI-1640洗涤2次，每次1500r/min离心5~10min。肿瘤细胞加人冻存液后液氮冻存备用。TIL则用含20% NCS的RPMI-1640调整细胞浓度为0.5 ×106/ml。
(8)将上述细胞悬液接种于24孔培养板(1m1/孔)，同时分别加人IL-2 1000U/或IL-2和CD3 McAb lug/m1，置37℃，5%CO2温箱培养3~4周，其间3~5d更换新鲜配制的含IL-2的RPMI-1640完全培养液。
(五)LAK细胞和TIL活性的测定
LAK细胞和TIL活性的测定基本同NK活性测定方法。但所用靶细胞为对NK不敏感的肿瘤细胞，如Rajf ，Dandi或自体肿瘤细胞。常采用同位素法如51 Cr释放试验、发光免疫测定法及MTT，比色法等。本节介绍MTT比色法。
(1)用含IL-2的20% NCS-RPMI-1640调整LAK细胞或TIL浓度至1.5×106/ml。
(2)
LAK细胞或TIL与不同的白血病细胞株按效靶为1：1~20的比例分别取100ul接种于96孔平底培养板内共同培养，每个试验做三个复孔。设不同浓度效应细胞200ul/孔单独培养，测定效应细胞的吸光度。同时将不同的白血病细胞株分别用20%
NCS-RPMI-1640培养液调整至3
×104一1×105/ml，取100ul细胞悬液和100ul培养液接种于96孔培养板中，每个浓度接种3复孔，以测定不同浓度肿瘤细胞的吸光度。
(3)将上述接种好的细胞培养板置37℃，CO2温箱孵育20h，其余步骤同IL-2生物活性测定。
(4)细胞毒性百分率(%)按下列公式计算
ODE + T=效应细胞孔OD值+靶细胞孔OD值
ODE=相应浓度单独效应细胞的OD值
ODT=相应浓度单独靶细胞的OD
