协同凝集试验
实验概要
本文以沙门氏菌为例介绍了协同凝集试验(Coagglutination test)的原理及操作流程。
实验原理
金黄色葡萄球菌细胞壁上的A蛋白(SPA)，具有和大多数哺乳动物IgG的Fc片段发生非特异性结合的特性，而IgG的Fab片段暴露在菌体的表面，仍保持抗体的活性，当与特异性抗原相遇时，IgG的Fab片段便与抗原结合起来，从而由抗原把已标记有IgG的SPA菌相互连接，而引起协同凝集反应。其特点是既保持了标记抗体的特异性，又提高了抗体的敏感性。含A蛋白的金黄色葡萄球菌在反应中起到载体和“放大器”的作用。
主要试剂
种类很多，较简单的一种为葡萄糖肉汤或琼脂，配方如下：
蛋白胨10 g
Na2HPO4•12H2O 2 g
葡萄糖1 g
氯化钠3 g
牛肉水1 000 ml
调pH值至7.8，即为葡萄糖肉汤培养基。如在其培基中加入琼脂25 g，即为固体营养琼脂。
实验材料
菌种：目前国际上公认的含SPA丰富的菌株叫CowanⅠ，菌种编号为ATCC12598或NCTC8530；我国卫生部药品生物制品检定所将该菌株编号为26111。
由我国筛选确定含SPA丰富的菌株有1800株、25株、799株、HH3株等。
国际上公认不含SPA的菌株是Wood46，卫生部药品生物制品检定所将该菌株编号为26107。以上菌种均可由卫生部药品生物制品检定所提供。
实验步骤
1. SPA菌稳定液的制备
1) 取CowanI或Wood46菌种，接种在肉汤培养基内经37℃培养18～24h，再转种有营养琼脂的克氏培养瓶中，每瓶3～5ml，摇匀，使菌液布满整个培养基表面，放37℃温箱培养18～20h。
2) 每瓶以10～20ml无菌生理盐水洗下菌苔，以3 000 r/min离心15min，弃去上清液，再用无菌生理盐水将沉淀悬浮后离心，如此再洗涤两次菌体，然后用含0.5%福尔马林的0.01mol/L pH值7.4的磷酸盐缓冲盐水制成10%的菌悬液(V/V)，室温放置3h或过液。
3) 将上述菌悬液放56℃水浴加热30min，迅速冷却，再用磷酸盐缓冲盐水洗离3次，最后用含叠氮钠(NaN3)为0.01%～0.05%的磷酸盐缓冲盐水制成10%(V/V)的菌悬液。4℃冰箱保存。
2. SPA菌诊断液的制备即将上述稳定液与已知的抗血清结合。
1) 取10%SPA菌稳定液1ml，离心弃上清，再用磷酸盐缓冲盐水洗菌体一次，并加缓冲盐水至1ml，悬浮菌体，然后加沙门氏菌AFO多价血清0.1ml，(注：血清预先放56℃水浴加热30min，进行灭活处理)。SPA菌和血清充分摇匀，放37℃水浴中作用30min，此间应不断振摇，以保持菌体呈悬浮状态，以利于菌体与IgG结合。
2) 将与抗体结合后的SPA菌液以3 000 r/min的转速离心15min，弃上清，并用磷酸盐缓冲盐水悬浮菌体洗离2次，以洗去未给合的剩余血清，最终加含0.05%～0.1%NaN3的缓冲盐水10ml。这种菌悬液即为1%标记的SPA菌诊断液。
在制备稳定液、诊断液的过程中，应同时作不含A蛋白的葡萄球菌及含A蛋白葡萄球菌与正常血清感作的对照。
3. 操作方法试验时，取诊断试剂一滴和待检或已知菌苔或抗原置于玻片上，用白金环或玻棒混匀，在数分钟内即可观察结果。一旦发生凝集，葡萄球菌凝集成清晰可见的颗粒。
注意事项
1. 制备好的SPA菌稳定液，于4℃冰箱中至少可保存8个月，并不影响其与抗体结合的性能。
2. 免疫血清的效价及特异性是本反应中的一个关键因素。只有具备良好的免疫血清，才能制备出敏感性高、特异性强的SPA菌诊断液。
3. 所用洗液及稀释液的pH值，是影响反应敏感性的重要因素。试验前要进行优选确定。在沙门氏菌的检测中，以应用pH值6.0 PBS效果较好。
4. 对被检标本进行煮沸处理，是消除非特异性反应的一种有效方法。
5. 反应特异性的证实，可用SPA菌特异性花结试验对凝集阳性反应物进行证实。具体方法是：钓取阳性凝集物，涂布于玻片上，进行革兰氏染色。镜检时，如见有革兰氏阳性的葡萄球菌和被检菌团聚在一起，则为真阳性反应，否则为假阳性反应。
