开发基于图像分析的病毒蛋白结合抑制检测方法

RBD特异性抗体通过阻断S蛋白和DPP4的结合，从而主导了MERS-CoV的宿主免疫原性反应。抗体也可以作用于其他表位，包括NTD和S2区域。研究者们测定了结合MERS-CoV S不同区域的单克隆抗体抑制MERS-CoV S与DPP4表达细胞的结合能力。以下的流程图为该方法的实验步骤。
 

Celigo通过绿色（AL488）、红色（PE）和蓝色（DAPI）荧光通道对样本进行了全孔成像和分析荧光细胞图片显示D12抗体（RBD特异性）（图4A，B）和G2抗体（NTD特异性，数据未显示）均以剂量依赖性方式抑制MERS-CoV S蛋白结合，病毒S蛋白的荧光强度（绿色荧光）随着抗体浓度的降低而减弱。FlowJo分析结果表明这两种抗体具有相似的IC50值（～7.5 nM），和它们已知的与MERS-CoV S的结合常数具有可比性 [5]。此结果与先前证明这些单克隆抗体与MERS-CoV S1结合的BLI实验结果一致。作为阴性对照，G4抗体的结合区域为S2,在空间上与RBD-DPP4的相互作用较远，因此没有显示出任何抑制作用，如图4E所示。

用假病毒中和实验验证结合抑制结果

以往的研究显示，测试的三种单克隆抗体（G2，D12和G4）都可有效中和MERS-CoV假病毒感染天然表达DPP4的Huh 7.5细胞 [5]。为了验证抑制结果的可靠性，研究者们进行了MERS-CoV England 1假病毒中和实验，以确定抗体对表达DPP4的BHK21细胞的中和模式与结合抑制方式是否相似。正如所预期的，G2和D12具有相似的中和曲线（图5），IC50值在0.5–0.8 nM范围内。而G4的IC50（图5）比D12和G2高一个数量级，与结合抑制结果一致。以往的研究也在Huh 7.5细胞中显示出D12 / G2和G4之间存在相同数量级的差异 [5]。

结语

近年来，HINT已被多家机构和制药公司用于病毒的抗体中和能力检测，例如被美国CDC用于H3N2型甲流病毒 [10], MedImmune用于呼吸道合胞病毒 [11]，中国食药监局用于H7N9型禽流感病毒等 [12]。HINT中的”Neutralization”（中和）不仅指抗体的中和作用，也可以广义地理解为非抗体类病毒药物/疫苗抑制病毒感染细胞的能力，因此在mRNA、DNA疫苗，佐剂，化学合成药物等的评估中也有很好的应用潜力。Celigo全视野细胞扫描分析仪具有分析整孔细胞的能力，在96孔板中扫描所有样品仅需10-15分钟，并且可以得到细胞数，细胞形态和荧光表达（包括未转染的细胞，细胞面积，平均荧光强度和总荧光强度）等结果。该方法可以快速地优化试验参数，例如细胞接种密度、细胞类型、蛋白选择和染色方法。另外，一块微孔板上可设置多个复孔和比较各种条件组合，能大大降低实验成本。Celigo高通量、高速度的特点以及强大的软件分析能力结合HINT技术可加速抗病毒药物和疫苗的开发，成为研究传染病的一种有价值的工具。

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参考文献

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