小鼠肌肉原代细胞的分离和生长（没有细胞分类）
| 实验材料 | |
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| 试剂、试剂盒 | |
| 仪器、耗材 | 用于断头术的器具或者是用于二氧化碳吸人的装置锋利的弯手术剪（灭菌）组织培养板灭菌的剃刀刀片尼龙网桌面离心机胶原包被的组织培养板带相位光轴的倒置显微镜 |
| 实验步骤 | 1.用断头术或者二氧化碳吸入法处死 1~5 只新生小鼠。 2.用 70% 的乙醇冲洗四肢，并用锋利的弯手术剪切下来。在立体解剖显微镜下工作，用钳状骨针将肌肉从皮肤和骨头上切下来。如果四肢都成功地切下来，将肌肉组织存放在一个的组织培养板中，滴上灭菌 PBS，确保这些累计的组织的无菌性。 3.加足够量的 PBS 保持组织湿润然后用剌刀在培养板中将其切碎成肉泥。然后加胶原蛋白酶/分散酶/氯化钙溶液，按每克 2 ml 的量加人（对于 1~5pups 的量加 0.5 ml), 继续切割几分钟。以上操作和接下来的步骤都在灭菌的组织培养罩上进行。 4.将切碎的组织转移到一个灭菌管中，在 37°C 的环境中培养直到混合物成了混合的较好的浆状（一般是 20 min)。在培养的过程中用一个塑料吸管轻轻地捣几次，以将成团的组织捣碎。 5.选做：将肉泥通过一个放在灭菌的漏斗里的尼龙网以滤除大片状的组织。这一步不是必须的，在接下来两天的培养过程中更多的细胞也许会从组织上脱离下来。 6.室温下 350 g，将细胞离心 5 min。去上清并加 2?4 ml(量的多少取决于正在处理的组织的量的大小）F-IO 肌肉原代细胞培养基。并植入到 35 mm，60 mm 胶原包被的组织培养板。 7.培养，每 2 天换一次 F-IO 肌肉原代细胞培养基并在带相位光轴的倒置显微镜下观察。不要将细胞在同一个培养板中培养多于 5d，这忽视了度。不要让细胞在小于 10% 的融合度的情况下生长也不要让细胞长得过密，因为细胞可能会开始分化或者死亡。小于 1:5 的比例稀释分离。 8.当细胞可以分离的时候，将培养基从培养板上抽洗掉，用室温 PBS 冲洗以便使少量的 PBS 残留在板上，然后用横向的拍打姿势对准板的上边缘剧烈地拍打板的垂直边缘以使细胞脱落。在细胞从塑料板上敲下来之前有必要在 PBS 溶液中培养几分钟。不要用胰蛋白酶或者 EDTA。 9.将细胞移重新植到一个新的胶原包被的组织培养板中，培养 15 min。使板中的液体漩动，然后将板倾斜朝向吸管的一边，将板来回地碰撞以使在洗走细胞的时候保持细在悬浮状态。将重悬的细胞转移到另外一个新的胶原包被的组织培养板。 10.重复第 8?9 步，这在培养扩大开始的几个星期或者直到获得成纤维细胞（很平整的细胞）之前是必要的，留下成肌细胞（致密的直径很小的细胞）。用 F_10/DMEM 肌肉原代细胞培养基而不是 F_10 肌肉原代细胞培养基继续培养。每 3 天而不是每两天更换培养基，但是避免细胞的过分生长。及时观察细胞确保成纤维细胞变化不明显。 原代肌肉细胞能够用标准的细胞培养方法冻存（附录 3)。生长了一个星期后，成纤维细胞通常会通过一个危机时期，这个时期中相当明显数目的细胞将死亡。剩下来的成纤维细胞将重新生长。 11.在融合度为 50%?70% 的成纤维细胞培养板中更换培养基，用分化培养基代替。重新培养，每天更换培养基。用带相位光轴的倒置显微镜观察是否出现多核肌管，多核肌管在数天到一周内应该是很明显的。在分化培养基—个星期后，有时会观察到肌管偶尔颤搐，因为收缩装置聚合了。 备选方案 1 使用细胞分选法纯化初级成肌细胞使用细胞分选技术可以把成肌细胞从混合培养的细胞群种分离出来。这种分离方法可以用来分离人和鼠的初级成肌细胞，对于人源成肌细胞，从 priorenzymatic 消化来的混合细胞群带有 5.IHll 抗体，可识别人神经细胞黏附因子。这些抗体可被当成来自 DSHB 的杂种瘤细胞。把这些细胞浮在未稀释的杂种瘤细胞上层孵育 20 min，然后置于 7jug/ml 的 biotinylatedanti-mouseIgG(Vectorlaboratories)20 min，并置于 lOjug/ml 的 TexasRedavidin(MolecularProbes)20 min，以上全部在室温中进行。 然后，这些细胞可适用于荧光分选法分选（FACS)stained 成肌细胞。通过 CA5.5 抗体和 mousea7-integrin(Blanco-BoseeiaZ.，2001) 反应，FACS 和磁性分选都可被用于分选初级成肌细胞。这种抗体可以从马鲛的腹水中获得，也许使用 G 蛋白柱状纯化可以得到可重复的结果。 展 |
